干细胞转染和分选（含Matrigel基质胶包被培养板和传代操作）
2024-03-18 09:45:16 0 举报
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干细胞转染和分选（含Matrigel基质胶包被培养板和传代操作）
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大纲/内容
转染试剂平衡至室温
每孔加入400μL转染试剂，摇匀。37℃，5%CO2培养
转染及状态观察
细胞从培养箱取出
按SOP中试剂及体积向离心管中依次加入①②③试剂，其中质粒每孔4μg，加入体积按质粒浓度换算
回收6孔板中Marigel基质胶，每孔加入1ml stemflex+1μM L755培养基，备用
配制好的转染试剂瞬离
分选后培养
分选
细胞悬液加到准备的6孔板，每孔500μL
转染试剂准备
配制细胞收集培养液：取15mL离心管，依次加入8mLstem flex培养基，16μLNormocin，1μM L755
注意事项：1.配制过程，在冰上操作；2.所有试剂和接触耗材需要先预冷；3.配制过程发现Matrigel基质胶结团，4℃过夜，至无肉眼可见结团才能分装。4.使用前需培养箱孵育1h
弃除孔中EDTA，span style=\"font-size:inherit;\
转染
细胞准备
Matrigel基质胶包被10cm培养皿，37℃培养箱孵育。
1mL移液器，1mL吸头，冰袋
冰上操作：取250mL培养瓶，加入80mL 0.15%明胶（预冷）；1mL吸头吹打在0.15%明胶中两次（预冷吸头），加入4管Matrigel基质胶，每管加入0.15%明胶润洗；再加入160mLDMEM/F12基础培养基
分选后
包被Marigel的6孔板培养箱中孵育，培养基平衡至室温
24h更换stem flex+Normocin培养基；每2天更换一次培养液，直至克隆形成
Matrigel基质胶包被培养板
24H后更换stem flex培养基；每天观察细胞状态及转染效率（荧光强度）
多能干细胞传代操作
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耗材、试剂及培养板准备
用细胞收集培养液补充至8mL/皿
stem flex扩增培养基配制：往10mL stem flex培养因子离心管加入stem flex基础培养基（已按1:100添加P/S青链霉素）至50mL。配制后4℃保存，两周内用完，使用前平衡至室温。
6孔板准备
弃上清，每管用0.3mL细胞保存液重悬细胞，将细胞悬液转移到40μm网筛的流式管中（管上提前标记），瞬离，膜上无残留即可。封口后待分选
用包被Matrigel胶的10cm培养皿收集4±1万细胞
消化细胞：弃上清，加入0.5mM 1mL/孔 EDTA消化细胞，镜检观察，细胞成圆形单个，边缘亮起，肉眼观察孔底变灰模糊，表示消化完成
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