植物细胞工程
2022-05-26 17:57:16 16 举报AI智能生成
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植物细胞工程是应用生物学原理和技术，对植物细胞进行遗传改良、增殖和培养的技术体系。通过植物组织培养、基因转化、体细胞杂交等方法，实现对植物的遗传改良，提高作物产量、抗病性、抗逆性等重要农艺性状。植物细胞工程技术在农业、林业、园艺等领域具有广泛的应用前景，为解决全球粮食安全和生态环境问题提供了新的途径。
作者其他创作
大纲/内容
基因工程--植物改良
次生代谢调控与生产
高附加值经济植物
珍稀濒危植物
转基因植物
育种原种
植物脱毒苗培育
植物快繁
脱毒植株
人工种子制作
种质保存
基础研究
为什么学？
概念
植物组织培养技术、植物细胞大批量培养技术、植物原生质体培养技术、植物体细胞融合技术、植物体细胞胚诱导技术、植物染色体融合技术、植物细胞器移植技术、植物基因工程技术、植物快繁技术、植物人工种子制作技术
植物细胞工程技术
创制植物新种质
生产次生代谢产物
保存植物种质
用于基础研究
快速繁殖植物
制作人工种子
胚、胚珠和子房以及试管受精克服远缘杂交不育性
花药、花粉培养育成单倍体植株
原生质体融合产生体细胞杂种
脱毒植物
植物品种改良
应用范围
研究植物形态建成的实验技术体系
植物再生、生理生化和遗传转化的技术体系
实现了试管开花和结实
核质关系
植物激素的作用机理
原生质体培养是单细胞研究的良好技术体系
利用离体突变技术分离和鉴定与植物发育有关的基因
有性繁殖植物遗传分离群体的构建
基因定位
利用花培加倍单倍体技术获得纯系
建立高效的植物再生体系
植物组织培养技术
植物离体受精技术
重要领域
茎段、幼苗及较大植株的培养--快速繁殖
植物组织和器官的培养
植物细胞和原生质体培养以及体细胞杂交--细胞工程
外源基因的遗传转化--基因工程
研究内容
细胞
植物细胞的全能性
基本理论
培养技术探索阶段（1902-1929）
培养技术建立阶段（1930-1959）
培养技术迅速发展阶段（1960-）
发展历史
植物细胞工程
生产新的更安全的疫苗
治疗遗传疾病
单克隆抗体治疗癌症
提供更好的新的药物
提高作物产量，降低生产成本
提高食物营养价值
提高牲畜生产力
用木质素制作地膜
开发可降解塑料
培养可转化DDT的细菌，净化土壤
减少水和空气污染
生物技术
外植体（Explant)
愈伤组织(Callus)
器官发生(Organogenesis)
植物体细胞胚(plant somatic embryos)
脱分化(dedifferentiation)
再分化(redifferentiation)
体细胞无性系及体细胞无性系变异(Somaclone and Somaclonal variation)
相关概念
第一章
玻璃、塑料和其他实验器皿洗涤与贮存室
培养基准备和灭菌室
无菌操作室
培养室
显微操作和观察室
人工气候室或温室
组成
酸度计、微波炉、PCR仪、纯水系统、摇床、移液器、酶标仪、水浴锅、制冰机
其他仪器设配
满足客户要求、设计合理、功能齐全、保障安全、应用方便、经济实用
设计原则
植物细胞工程实验室的组成与设计
处理有毒试剂应采取适当的预防措施
用于细菌培养的器皿要进行高压灭菌处理
实验操作要规范
配备有急救箱
实验室安全
第一节 实验室的设计和基本设备
所有培养器皿、培养基、外植体、培养环境、用于培养的工具、操作过程、操作者本身、超净工作台
污染来源
不含水、耐高温的新器皿工具、污染器皿和用具等
对象
烘箱（160-180摄氏度、2或3小时以上）
酒精灯（微生物、用具、玻璃器皿）
方法
干热灭菌法
采用热蒸汽进行灭菌
原理
不耐100摄氏度高温的物品或有机溶剂
间歇灭菌法
耐高压的物品或有机溶剂
高压灭菌法
内容
仪器--高压灭菌锅
湿热灭菌法
利用热辐射及干热空气进行灭菌
玻璃器皿、瓷器、金属器具等耐热物品、注射器、安瓿等、包装纸、棉花等纤维物、凡士林、部分粉剂
适用对象
热力灭菌法
波长200-300nm的紫外线具有杀菌效果
常用紫外线灭菌
病房、实验室、手术室等
适用范围
紫外线对人体有害，避免直接在紫外线下操作
注意事项
辐射灭菌法
加热已被破坏，也不能用化学方法处理的液体或气体，如抗生素、维生素、酶、血清、通入发酵罐和无菌空间的气体
玻璃棉、陶瓷、石棉、醋酸纤维素滤膜
过滤材料
0.45微米滤膜可过滤酶系或小量液体培养基
0.20微米滤膜除去病毒以外的所有微生物
滤膜孔径0.45或0.20微米
一次性过滤器（少量液体）、蔡氏滤液器、玻璃滤液器、滤膜滤液器等
细菌过滤器
过滤除菌法
物理方法
能杀灭各种类型的微生物，但对机体组织和被消毒物品的损伤程度小
作用迅速，能穿透被消毒的物体
易溶于水，性质稳定而不易分解，没有难闻气味，不会使消毒品褪色或脱色
价格低并且运输、使用方便
灭菌剂应具备条件
溶解度-可溶于水
浓度-适当，越高，杀菌效果越强（酒精除外）
环境中存在的有机质-清洗干净，因为有机质与消毒剂发生反应，减弱消毒剂的杀菌效力
微生物的种类-敏感性不同，70%酒精只能杀死致病菌的营养型，对芽孢无作用
使用灭菌剂应考虑问题
喷洒房间或处理污染物表面
杀死细菌营养体，对芽孢作用不大
苯酚（石炭酸）3-5%；甲酚 甲酚皂（来苏儿）
酚类
较强的杀菌作用
甲醇（有毒）、丙醇、丁醇、戊醇、苯氧乙醇
常用：乙醇 70%-75%，处理外植体、皮肤、器皿等
醇类
高锰酸钾强氧化剂，医药上称pp粉
3-6%双氧水；0.2%过氧乙酸：强氧化性和腐蚀性，迅速杀灭细菌及芽孢、真菌、病毒等微生物
氧化剂（过氧化物）
杀死细菌及芽孢、真菌、病毒等微生物
戊二醛；甲醛：福尔马林（35%-40%）；甲醛室内消毒：加热熏蒸、氧化熏蒸
常用甲醛、戊二醛熏蒸房间
醛类
常用为漂白粉、0.1%氯化汞、次氯酸钠
含氯化合物
常用0.1-0.5%新洁尔溶液，消毒污染表面
季胺盐类
常用灭菌剂
化学方法
灭菌方法
常用灭菌方法
玻璃和塑料器皿的洗涤与灭菌
操作过程中反复使用的工具，通常用95%乙醇火焰灭菌
操作工具的灭菌
清洗外植体；超净工作台内70%乙醇30s；无菌水冲洗3次；0.1%氯化汞5-8min或更长；无菌水冲洗5-6次；超净工作台内接种；培养室内暗配养或光照培养
植物材料的灭菌
某些生长素，如GA、玉米素、ABA、尿素和某些维生素不耐热，不应该通过高压蒸汽灭菌
培养基的灭菌
无菌操作室和培养室内除经常保持清洁外，需定期进行熏蒸灭菌。常用甲醛进行熏蒸
培养架和地面可用1%-2%来苏儿水（煤酚皂溶液）擦拭
无菌操作前先打开紫外灯照射对室内进行灭菌
无菌操作室的灭菌
超净工作台灭菌
操作者具体操作过程
实验室基本操作规程
血球计数板构造
培养细胞密度的测定
了解培养细胞的数目和生物量的变化
将15mL细胞悬浮液置于刻度离心管中，然后再2000xg的离心力下离心5min。记录离心管内沉淀的细胞体积，然后计算出每毫升细胞悬浮液中细胞体积（mL），用来表示细胞的生物量
培养细胞体积的计量
鲜重法：在植物悬浮培养细胞继代培养时，取一定体积的悬浮细胞培养物，置于称重的离心管内，离心收集后，称重，得到细胞的鲜重，计算出每毫升悬浮液中细胞的鲜重。每个2天取样一次，共7次，每个样品重复3次，整个实验过程中不再往培养瓶中加入新鲜培养液。以鲜重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制鲜重增长曲线
干重法：在称量鲜重之后，在60摄氏度的烘箱内将细胞烘干至恒重，称量其干重，计算出每毫升悬浮液中细胞的干重。以干重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞干重生长曲线
培养细胞鲜重和干重测定及绘制生长曲线
植板率（%）=（平板上形成的细胞团数/平板上接种的细胞数）x100%
酚藏花红染色法
荧光双醋酸酯（FDA）染色
台盼蓝染色法
MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，并不能测定细胞绝对数
四唑盐（MTT）比色法
细胞活力检测
细胞计量与活力检测技术
第二节 实验室的基本操作技术
第二章
较高浓度的硝酸盐、铵盐和钾盐，微量元素种类也很多。如MS培养基以及改良的MS培养基
特点
含盐量较大的培养基
培养基盐浓度也很高，尤其是硝酸钾的含量较高，如B5、N6、SH。培养基中的铵离子和磷酸根离子由磷酸二氢铵提供
硝酸钾含量较高的培养基
这类培养基中大量元素为MS的1/2，微量元素种类减少，但含量增加，维生素种类比MS多，如H培养基
含盐量中等的培养基
无机盐的数量比较低，这类培养基包括White培养基、WS和HE培养基等
低盐浓度的培养基
分类
前两类培养基比较适合愈伤组织诱导和细胞培养，但选用哪一类培养基，应依植物种类、基因型和外植体等而定；诱导愈伤组织常用的培养基为MS和B5。高盐浓度的培养基可能对培养过程中愈伤组织数量及鲜重的增加有利。
后两类培养基有利于根的形成
比较
根据目前常用培养基配方中含盐量多少进行分类
外植体诱导愈伤组织--诱导愈伤组织培养基中的生长激素
愈伤组织诱导再生植株（注：不同激素可诱导不同再生方式）培养基中生长激素
作用
降低或除去原来细胞增殖培养基中的生长素
调整培养基中生长素/细胞激动素的比例
除了激素比例外，也要注意所加激素的绝对量的影响
要注意所用生长素和细胞激动素的种类
提高培养基中的氮含量及其他盐的浓度
注意顺序改变培养基的激素成分及其他营养物质
促进组织和细胞培养中器官分化和胚状体的形成应注意
植物生长调节剂
糖的浓度和种类
有机添加物
无机营养物质
有机营养成分
培养基组分对愈伤组织诱导和形态建成的影响
常用培养基的特性与分类
培养基的发展过程
大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S
微量元素:Fe、Cu、Mn、Co、Mo、B、I、Zn、Cl等
注意：铁盐，在配培养基时单独
各种培养基中无机N都以两种形式供应：硝态氮和铵态氮
必要的矿质元素（无机营养元素）
硫胺素--维生素B1、烟酸--维生素B3、泛酸钙--维生素B5、吡哆素--维生素B6
维生素类物质
肌醇、水解酪蛋白（CH）、椰乳（CM）、玉米乳、麦芽提取液（ME）、番茄汁、酵母提取液（YE）
其他
含氮物质
常用碳源为蔗糖、果糖、葡萄糖，其中蔗糖是最常用的，浓度为2-5%
其他形式碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露醇、乳糖
碳源
有机营养元素
常用生长素
在组织培养中主要用于细胞分裂和根的分化
生长素
Kt--激动素、BAP(6-BA)--苄氨基嘌呤、2-IP--异戊烯腺嘌呤
常用
在培养基中主要是与从愈伤组织和器官上分化不定芽有关
细胞分裂素
赤霉素（GA3），较生长素和细胞分裂素少用，可溶于水
赤霉素
种类
激素的种类、浓度（绝对量）和配比对愈伤组织诱导、植株再生的作用
注意
生长激素
琼脂并不是培养基必要的成分，对培养物起到支持作用；使用浓度0.8-1%，若浓度过高，培养基会变硬，营养物不易扩散到组织中
琼脂
植物细胞和组织培养的培养基组成成分
培养基的基本成分和主要培养基
固体培养基
液体培养基
类型
通常为5.0-6.0，pH<5.0培养基不能很好胶化；pH>6.0培养基硬度大。目前多采用pH=5.8
培养基的pH值
培养基的类型
查阅以往的研究确定基本培养基；或选择一种通用培养基，如MS培养基
确定改良培养基的主要成分与浓度变化梯度
正交试验设计进行优化
根据离体诱导物的生长状况以及生长曲线等，筛选培养基，找出比较适合的培养基
培养基的选择与筛选--如何设计和筛选
配制母液：分大量元素、微量元素、铁盐、有机营养物质、碳源、生长激素等六大类
按培养基要求将各种母液和糖加到容量瓶中并定容
测定pH，用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节
加入琼脂，在水浴锅中融化混匀
分装、灭菌
培养基配制
培养基的选择及制备
第三章
植物细胞（体细胞或生殖细胞）均含有该物种全部的遗传信息，每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜力
定义
以植物的体细胞（如根、茎、叶等）为培养材料，诱导形成完整植物体。
以植物的生殖细胞（如小孢子和大孢子细胞）为培养材料，诱导形成完整小植物体
培养去壁的原生质体，使原生质体发育成为完整植物体。
利用诱导剂，促使两个不同种的原生质体相互融合后进行培养，使其发育为杂种植物体。
将遗传信息（基因）利用不同基因载体（Ti或Ri质粒）导入植物细胞，通过离体培养使之再生成具有新性状的植物体。
实现途径
细胞分化是多细胞生物体形态发生的基础
细胞分化在植物形态建成中是一个核心问题，没有细胞分化就没有形态建成
植物发育和细胞分裂、生长、分化有时间和空间上的必然联系
细胞分化
器官分化途径
胚状体发生途径
途径
培养基成分、pH、温度、光照、基因型、激素
主要影响因素
DNA、RNA和蛋白质的合成
氮同化和氨基酸代谢
碳水化合物的代谢与利用
内源激素的平衡
植物再生的生理生化基础
器官分化
细胞分化和器官分化
选用长度0.5cm左右的茎尖为外植体
培养材料的采集
将材料用流动的自来水冲洗净，再用蒸馏水冲洗，用无菌纱布或吸水纸吸干水分，在用消毒刀片切成小块；在无菌环境中将材料放入70%乙醇中浸泡30~60s后，用无菌水冲洗2~3次；将材料移入漂白粉饱和液或0.1%氯化汞溶液中消毒6~12min；取出后用无菌水冲洗3~6次
培养材料的消毒
制备外植体
在无菌环境下，将外植体接种在适宜培养基上，封口培养；培养环境：温度25摄氏度左右，光照12h/d
接种和培养
根的诱导
炼苗与移栽
过程
器官培养
对植物的胚（成熟胚、幼胚）及胚器官（如子房、胚珠、胚乳）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗
克服杂种胚的败育，获得稀有植物
获得单倍体和多倍体的植株
打破种子休眠，促进胚萌发
快速繁殖良种，缩短育种周期
克服种子生活力低下和自然不育性，提高种子发芽率
提高后代抗性，改良品质
种子活力的快速测定
种质资源的搜集和保存
用于理论研究
意义
原胚期的离体胚培养很难成功；幼胚培养不易成功
与胚龄密切相关
影响因素
胚培养
为试管受精（即离体受精）提供雌配子
诱发大孢子发育成单倍体植株用于育种
未受精胚珠培养
对研究合子及早期原胚的生长发育、促进胚的发育等具有意义
受精胚珠培养
目的
胚珠剥离时期的选择、胎座的有无、接种前的预处理、培养基、培养条件
胚珠培养
基因型、外植体的发育程度、接种前的预处理、花被组织
子房培养
基因型、胚乳的发生类型和发育程度、胚的参与、培养基和培养条件
胚乳培养
在无菌条件下，将表面消毒的未授粉子房切开，取出胚珠，接种在适宜的培养基上进行培养；在试管内散播花粉；花粉萌发后，花粉管伸入胚珠内受精；受精后的胚珠进一步发育形成种子，种子能在培养基上发芽长成植株
培养基类型、激素种类和浓度、pH
培养基
花粉的灭菌
鉴别受精的标记性状
母体组织的影响
成功的因素
离体受精
胚状体培养
第四章
无性繁殖并大量扩繁被培养的植物
为细胞悬浮培养和次生代谢产物生产与利用、原生质体培养和细胞融合提供易于操作的起始材料
为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的体系和基础
为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操作对象
为种质资源的保存提供新的形式
为离体研究植物组织和细胞分裂、分化、代谢和状态的转变创造适宜的材料和体系
愈伤组织培养的目的
愈伤组织培养的定义
改变原来的分化方式和代谢方式，合成代谢加强，合成大量蛋白质和核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定基础
诱导期
外植体外层细胞开始分裂，细胞脱分化，愈伤组织结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明
分裂期
愈伤组织表层细胞分裂逐渐停止，而转向其内部的局部地区，并改变分裂面的方向，出现瘤状结构外表，愈伤组织中可以发现维管组织，但不形成维管系统
分化期
愈伤组织形成的三阶段
疏松易碎的愈伤组织、坚硬/木质化的愈伤组织、水渍粘稠的愈伤组织
从质地上分类
愈伤组织无任何形态结构，新鲜愈伤组织颜色为奶黄色或白色有光泽，少数也有淡绿色或绿色或红色；老化的愈伤组织则转变为黄色至褐色
从颜色上分类
愈伤组织的类型
愈伤组织生长周期
制作生长曲线
继代时应注意愈伤组织分割
愈伤组织继代培养
拟分生组织与器官发生
愈伤组织保持时间
继代时间与植物再生能力及变异
愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成分和培养时间而异
同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同的变异
组织培养中涉及到遗传变异主要是细胞核组成的改变，变异是不可逆的，这种遗传上的改变可以是染色体畸变，细胞核破碎，或者是由于细胞内复制引起的多倍性以及分子水平上的改变形式
培养基成分，特别是外源激素的成分与变异的产生密切相关
愈伤组织继代时间与植物再生能力和遗传稳定性
愈伤组织的诱导和形成
通过产生单极性的不定芽，再在不定芽的下方长出不定根，同时在二者之间形成维管束组织，进而形成完整植株，多数植物属这种类型
产生单极性的不定根，再在不定根的上方产生不定芽，并在二者之间分化出维管束组织，形成完整植株，这种类型在双子叶植物中较常见，而单子叶植物则少有
愈伤组织仅分化出不定根或不定芽，而形成无根苗或无苗根
在愈伤组织临近部位分化出不定根和不定芽，然后两者在结合起来，形成完整植株，此时根和芽的维管束一定要相连，否则植株不能成活（丛生苗）
通过体细胞胚胎途径再生植株，也是一种较为常见的类型
愈伤组织形态建成的方式
外植体细胞经离体诱导所形成的愈伤组织并不完全都具有形态建成的能力
具有形态建成能力的愈伤组织都具有一定的形态结构特点
具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织之间的差异是相对的，有时通过控制培养条件，尤其是生长调节物质和继代方式可以调控其进行形态建成
具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织
愈伤组织形态建成
影响愈伤组织诱导率；影响愈伤组织芽分化率、植株再生率；影响愈伤组织的生物量
基因型--重要影响因素
外植体的类型影响愈伤组织诱导率、形态及植株再生；外植体年龄影响愈伤组织器官发生的能力
外植体
愈伤组织在培养基上保持的时间
含盐量较大的培养基、硝酸钾含量较高的培养基、含盐量中等的培养基、低盐浓度的培养基
依培养基配方中含盐量多少分4类
培养基类型
生长素和细胞分裂素、乙烯
生长调节物质
在愈伤组织的诱导和继代培养中都加入一定量的有机成分来满足愈伤组织的生长和分化要求；糖的浓度和种类对组织培养物的增殖和器官分化均有明显的影响
有机成分
愈伤组织缺无机营养表现症状
无机营养成分
培养基pH值影响愈伤组织对营养元素的吸收、呼吸代谢、多胺代谢和DNA合成以及植物激素对细胞的影响，从而影响愈伤组织的形成及形态建成
培养基pH
吸附培养基中某些成分，如激素、琼脂中不纯抑制物等；吸附外植体释放到培养基中的分泌物，如激素、酚类物质；吸附培养基中某些气体成分；活性炭释放到培养基中某些杂质影响培养物的代谢；造成基质的黑暗，使其更接近自然土壤
活性炭等一些惰性物质
影响愈伤组织诱导率、鲜重干重；影响愈伤组织的形态、颜色、质地；影响愈伤组织的活性成分
光质
影响愈伤组织的增殖和形态；影响愈伤组织的活性成分
光强
影响愈伤组织起始时间、诱导率和形态；影响愈伤组织形态和质地；影响愈伤组织形态建成
培养基成分
愈伤组织的形成及其形态建成的调控
愈伤组织在培养基上生长，在一定条件下首先形成导致类形成层的细胞成群出现，称为分生原基。
在生长中心出现管胞细胞，并进一步维管化，这是愈伤组织中器官形成部位，最初的分生原基具有可塑性，可形成芽或根
芽的分化
为芽形成提供物质和能量
淀粉积累、蛋白质和和酸含量较高
生长在同一种培养基上的处于分化的愈伤组织和未分化的愈伤组织间内源激素的水平明显不同
内源激素水平变化
细胞激动素类化合物在器官发生过程中可能作用于基因表达的翻译阶段
外源激素和器官分化
目前已公认与分化有关的标志酶为过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、甲基转移酶
分化标志酶活性的变化
芽分化过程中生理生化基础
在外植体上已存在有根原基，即根原基不是重新发生的，常与取材部位有关
在外植体上重新分化根原基而发生不定根，如从茎尖、茎段分化不定根
外周分化型
在维管组织附近分化出不定根
从愈伤组织分化不定根
不定根发生与分化的形态学变化
不定根的分化
蛋白质与核酸的合成
在形成根原基的部位细胞里有大量的淀粉积累，淀粉酶活性提高为不定根形成提供物质和能量
淀粉积累
不定根分化的生理生化基础
愈伤组织形成及其形态建成的生理生化
在愈伤组织形成和形态建成中植物生长调节物质可能起着“开关”的作用
细胞分裂素和生长素是愈伤组织增殖的基础，其中细胞分裂素起着重要作用
诱导细胞脱分化形成愈伤组织，首先必须使已停止分裂活动的细胞恢复分裂活性
cdc2/CDC28基因已被证实是调节细胞分裂周期的基因
WIND1是参与创伤诱导细胞重编程的关键调节因子
愈伤组织形成及其形态建成的分子基础
青钱柳
生产贝母碱
贝母
印度木槿
生产蒽醌衍生物
水杨酸和乙烯利诱导产生的色素增加了12-13倍
生产纺织染料
决明子
生产人参皂苷
人参
光诱导对川芎愈伤组织生长、抗氧化酶活性和药用化合物含量的作用效应
川芎
愈伤组织在次生代谢产物生产中的应用
第五章
用于生产人工种子
用作植物遗传转化受体
用于植物的快速繁殖
用于研究植物的细胞分化
植物体细胞胚发生与调控的作用
在离体培养过程中，由植物外植体或愈伤组织产生与受精卵发育方式相似的胚状结构
植物体细胞胚的定义
具有两极性、存在生理隔离、遗传性相对稳定、重演受精卵形态发生的特性
植物体细胞胚发生的特点
直接途径：直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成
从愈伤组织或悬浮细胞、有时也从已形成的体胚的一组细胞中发育而成
间接体细胞胚胎发生中，外植体已分化的细胞先脱分化，并对其发育命运决定而诱导出胚性细胞--诱导胚胎决定细胞（IEDCs），进而形成体细胞胚
间接途径
植物体细胞胚发生的方式
体细胞胚胎发生是由单个或一组营养细胞形成与周围组织无维管结构的两级结构
体细胞胚发生途径有直接途径和间接途径，但无论哪一种发生途径，绝大多数研究报道认为体细胞胚胎起源于单细胞，从多种植物中都观察到单个胚性细胞，有不均等分裂的二细胞原胚和均等分裂的二细胞原胚、多细胞原胚、球形胚直到成熟胚。也有研究认为起源于多细胞
结论
体细胞胚的起源
在同一块愈伤组织或一个胚性细胞复合体上可以观察到多个不同发育时期的体细胞胚，从单个原始细胞到多细胞的原胚、球形胚、鱼雷胚直至具子叶的胚状体，这是由体细胞胚发生和分裂的不同步所致
单细胞起源体细胞胚发生和发育的时期
基因型、外植体、培养基、光照
陆地棉花体细胞胚同步化的诱导继代培养在垫滤纸固体培养基上
物种、基因型、外植体、培养基、诱导方法
调节体细胞胚发生同步化方案
体细胞胚发生的影响因素与调控
一般来说，胚胎一旦被分化出来或甚至完成诱导之后转移到基本培养基上即可发育成熟，并形成小植株
体细胞胚发育成植株的能力
一种是体细胞胚不完全萌发，即只有芽而无根或只有根而无芽
另一种是体细胞胚早熟萌发，即体细胞胚还未表现出完整的胚结构之前就已萌发，萌发时盾片膨大形成一叶状体，也在叶状体基部长出芽
体细胞胚萌发的两种不正常现象
发芽
根系的发育
芽分生组织的生长和发育
真叶的生长
芽和根的连接
正常植株生长
体细胞胚发育成植株，大致经历几个阶段
体细胞发育成植株的能力
第一节 植物体细胞胚发生
体细胞胚的发育
体细胞胚胎发生的实质是细胞分化的问题，而细胞分化的分子基础是基因表达与调控的结果
体细胞胚胎发生的实质
认为一个细胞系的细胞质因子间的相互作用是一个原发稳定基因组中基因活化的结果，从而使该细胞系与其他细胞系不同
理论
第一阶段为预定阶段，细胞接受了或预定了特殊发育命运，但未表现出可见的特化标志，这种特性一旦建立就可以在细胞继代培养中得以稳定保持
第二阶段为表达阶段，在适宜条件诱导下，预定的细胞（PEDC）发生一系列生理生化和形态上的变化，表现出分化的特性，但由于这种表达与培养过程中诱导因素密切，而表现为一种生理反应，是不稳定的
阶段
渐变理论
体细胞转变为胚性细胞的机制
通过生长素偶联和转运参与调节生长素水平的蛋白质的积累，包括吲哚-3-乙酸-酰胺合成酶（GH3）和肌动蛋白解聚因子（ADF2）等
与能量产生有关的蛋白、细胞壁重构蛋白、细胞内转运蛋白等的积累
糖蛋白的积累：如阿拉伯半乳糖蛋白
其他：类叶绿体蛋白、过氧化物酶、热休克蛋白、谷胱甘肽s-转移酶、晚期胚胎发生丰富蛋白等
蛋白质的差异积累
在由植物愈伤组织诱导形成体细胞胚过程中，伴随着淀粉的合成，但不同时期淀粉的合成与积累不同
淀粉的积累
体细胞胚发生的理化基础
芽分生组织基因
根分生组织基因
胚形成基因
体细胞胚发生的分子基础
体细胞胚具有遗传上的相对稳定性，但这种遗传上的相对稳定性主要依赖于基因型
体细胞胚的遗传稳定性
第二节 植物体细胞胚发生中基因表达与调控
第六章
人工种子用于蔬菜、饲用豆科植物、工业用重要农作物、香料植物、大田农作物、水果、药用植物、林木等多种经济作物的生产
植物无性繁殖的主要障碍之一是繁殖体不能进行长距离的运输：如观赏植物、兰花植物的人工种子与快繁
人工种子用于对通过传统方法和天然种子难以萌发的农业植物和濒危植物物种的增殖和保护
为什么学习人工种子？
人工种子研究现状
所谓人工种子是将细胞培养中形成的体细胞胚或不定芽以及来自植物体的芽、腋芽、圆球茎或任何其他分生组织包埋在能提供养分（人工胚乳）的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜（人工种皮），造成一种类似于天然种子的结构
人工种子可在一定条件下萌发生长，形成完整的植株
人工种子的概念
包埋在人工种子内部的体细胞胚或不定芽，植物自身的芽、腋芽、原球茎等，在一定条件下都能萌发生长，并形成完整植物的能力
体细胞胚或不定芽，植物自身的芽、腋芽、原球茎等
人工胚乳为体细胞胚或不定芽，植物自身的芽、腋芽、原球茎等萌发和生长提供营养物质。
根据使用者的目的，可向人工胚乳内自由添加有利于胚状体正常萌发所需的各种营养成分、防病虫物质、植物激素等，也是人工种子优越于天然种子之处
人工胚乳
包裹在人工种子的最外层，对人工种子起到保护作用，保护人工种子内部的水分和营养不致丧失和防止外部物理冲击，还要保证通气
人工种皮
人工种子各部分功能
裸露的或休眠的繁殖体，可以直接播种，如休眠的微鳞茎和微型薯等
人工种皮（聚氧乙烯等多聚体）包裹的繁殖体
水凝胶法包埋的体细胞胚、不定芽以及休眠的小鳞茎等繁殖体，水凝胶中可含有多种养分和激素，促进繁殖体的生长
液胶法包埋的繁殖体
根据包裹材料不同，可将人工种子分为以下4种类型
人工种子种类
可对一些自然条件下不结实的或种子很昂贵的植物进行繁殖
固定杂种优势，使F1杂交种可多代利用，使优良的单株能快速繁殖成无性系品种，从而大大缩短育种年限
节约粮食
在人工种子的包裹材料里加入各种生长调节物质、菌肥、农药等，可认为地影响控制作物生长发育和抗性
可以保存及快速繁殖脱病毒苗，克服某些植物由于长期营养繁殖所积累的病毒病等
与试管苗相比成本低，运输方便（体积小），可直接播种和机械化操作
人工种子与天然种子比较有其自身的特点
高质量和数量体细胞胚的诱导
体细胞胚发生的同步控制
人工种皮的制造与生产
人工胚乳的研制
工艺流程
贮藏
目前用体细胞胚生产人工种子涉及的问题
获得体细胞胚是生产人工种子的基础，其发生频率的高低、胚的质量和体细胞胚发生的同步控制是生产人工种子的关键
人工种子生产的关键
体细胞胚的诱导与同步化
人工种子的包埋
人工胚乳的制作
人工种皮的制作
人工种子的贮藏
用体细胞胚制备人工种子的步骤
第一节 人工种子的概念与发展状况
高质量和高产量的体细胞胚诱导与同步化控制体细胞胚的诱导与同步化控制方法
包埋材料必须对体细胞胚无损害和无毒性，并能保护胚和胚发芽的能力
同时在制造、贮藏、运输和种植过程中必须具有耐久性
胶囊必须含有养分和植物激素以及植物生长和发育所需的成分和水分，并要求制作的人工种子适合于农业机械化播种
进行包埋时应做到以下几点
滴注法、装模法
经研究认为藻酸盐所形成的胶囊是目前最好的凝胶包埋材料，所采用的方法主要有两种
包埋方法
获得发育正常、形态上较为一致的体细胞胚后，就要用合适的材料进行包埋
人工种子包埋
目前美国杜邦公司生产的Elvax4260是一种较好的“人工种皮”材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三种物质共聚的产物，用它作为人工种子最外层的包裹剂，即人工种皮取得较好的效果
目前用在人工种皮最好的材料
将4g藻酸钙胶囊置于20ml含0.1g葡萄糖和含0.2ml甘油的氢氧化钠溶液中搅拌1min；在50ml环乙烷中加入10%的Elvax4260；在40摄氏度条件下溶解5g硬脂酸，10g鲸醋醇和25g鲸醋取代物，另加295ml石油醚和155ml二氯甲烷；将藻酸钙胶囊放在上述的混合液中浸泡10s，取出后用热风吹干。如此重复4-5次，最后用石油醚冲洗干净，经尼龙布过滤后在空气中风干即可
用Elvax作为人工种皮的具体操作程序
人工种皮的研制
第二节 人工种子的研制
转换（transformation)指人工种子在一定条件下，萌发、生长、形成完整植株的过程
人工种子转换定义
也称离体条件的转换。一般是将新制成的人工种子播种在1/4MS培养基，附加1.5%麦芽糖、8g/L的琼脂中，培养后统计人工种子形成完整植株的数目，即人工种子的转化率
对提高体细胞胚质量的培养基成分的研究；改进转换条件的研究。如麦芽糖代替蔗糖，有利于体细胞胚的萌发和转换
无菌条件转换率的高低主要取决于
无菌条件下的转换
也称活体条件的转换。人工种子真正的目的是直接播种于土壤，即在活体条件下，是转换成功
无土培养试验：目前以蛭石或珍珠岩试验较多，附加低浓度无机盐，1/6MS培养基，0.75%麦芽糖有利于转换
土壤试验：人工种子的土壤转化试验报道较少。苜蓿人工种子的直接土壤转化试验已达20%，水稻不定芽研制的人工种子经适当地过渡性培养，在土壤中的转化率为10%
土壤条件下转换采用方法
研究无机盐在转换中的重要性时表明，没有硝酸钾、硫酸镁、氯化钙时就不会发生转换，缺乏磷酸铵，转化率从30%降至5%。显然这些无机盐成分作为人工种子营养肥料是不可缺少的
0.75%（W/V）的麦芽糖有利于提高转化率。因此推断，碳源在人工种子转换中也是限制因子
因此，必须在人工种子中贮藏必需的养分或供给外源营养物质
土壤条件的转换人工种子转化率低的主要限制因子
土壤条件下的转换
转换方法
人工种子储藏时间的长短和萌发率的高低对人工种子的应用至关重要。人工种子的寿命，其最理想的状态是能够与真正的合子胚种子的寿命一样长，只有这样，才有利于人工种子的储藏和萌发
此外，海藻酸盐胶囊本身又抑制呼吸，更加缩短了体细胞胚的寿命。因此，储藏和萌发是人工种子研制的主要难点之一
低温储藏是指在不伤害植物繁殖体的前提下，通过降低温度来降低繁殖体的呼吸作用，是指进入休眠状态
常用的温度一般是在4摄氏度。在此温度下体细胞胚人工种子可以储藏1-2个月
低温法
干化的人工种皮更像天然种子，具有更长的储藏寿命
干化增强人工种子幼苗的活力，可能与其超氧化物酶和过氧化物酶的活性显著提高，从而减轻低温贮藏对体细胞胚的伤害
干燥法
抑制法
液体石蜡作为经济、无毒稳定的液体物质，常被用来储藏细菌、真菌和植物愈伤组织。美国已有报道，把人工种子放在液体石蜡中，保存时间可达6个月以上
液体石蜡法
超低温一般是指-80摄氏度以下的低温，如超低温冰箱（-80~-150摄氏度）、液氮（-196摄氏度）等
在此温度下，植物活细胞内的物质代谢和生命活动几乎完全停止。所以，植物繁殖体在超低温过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能
超低温储藏法
延长人工种子储藏时间和提高其萌发率的主要方法包括低温法、干燥法、抑制法、液体石蜡法等以及这些方法的组合
干燥法和低温法是目前应用最多的方法
人工种子的储藏与萌发
第三节 人工种子转换试验
许多有价值的基因作物，特别是那些不易获得种子和自然增殖率极低的植物，目前尚未显示出较好的体细胞胚发生能力，或胚的生活力差
有些作物虽然可以诱导出体细胞胚，但胚胎发生机制研究不够，而且同步化等技术尚未解决，因而难以达到大量控制同步化的目的
人工种子的成本远高于自然种子
人工种子储藏、运输和加工以及机械化播种，尚未完全解决，许多问题尚待进一步研究和探索
人工种子的应用目前存在的问题
提高封装繁殖体的发芽率
提高合成种子的转化频率
首先应考虑该作物的价值
要考虑那些很难获得种子，而且自然增殖率极低的植物
人工种子的应用应该考虑哪些问题
第四节 人工种子的应用前景
第七章
植物细胞作为食物
植物悬浮细胞培养是次生代谢产物生产的生物工厂
植物悬浮细胞生产重组蛋白，包括抗体、疫苗和其它治疗剂
作为植物细胞分化研究的平台
用于体细胞胚生产和原生质体培养的外植体；外源基因遗传转化的受体
为什么学习植物细胞悬浮培养与次生代谢产物生产?
植物细胞悬浮培养是指植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养，这些细胞或小的细胞团来自愈伤组织、或某个器官、或组织，通过物理或化学的方法进行分离而获得
植物细胞悬浮培养的定义
分批培养是指将细胞接种在一个与外界隔绝、只允许气体和挥发性的代谢产物进行交换，且营养液体积保持不变的密闭系统中培养
培养基体积固定；培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈S增长；必须适当搅拌
滞后期：细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关
对数生长期：细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变
直线生长期：细胞生长和发育最明显的时期
减缓期：生长逐渐缓慢，培养液消耗将近，有毒代谢物质增多，氧气减少
静止期：生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡
分批培养生长曲线及其各时期特点
用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶中，继续进行培养
继代方法
了解细胞数目增加变化S形曲线后，选择对数生长期和直线生长期
最佳继代时期
分批培养（batch culture)
连续培养是指将细胞接种在一定容积但非封闭的反应器中，在培养过程中不断注入新鲜培养基，使培养细胞连续得到营养物质补充，细胞的生长增殖连续进行
开放式培养（培养细胞数目保持恒定）
封闭式连续培养（培养细胞数目不断增加）
可分为两种类型
可用于次生物质的大量生产
连续培养（continuous culture)
悬浮培养的基本形式
细胞计数、细胞体积、细胞鲜重、细胞干重
细胞生长量的计算
荧光素双醋酸酯法、台盼蓝染色法、四唑盐（MTT）比色法、酚藏花红染色法
细胞活力的测定
悬浮培养中细胞生长量的计算和活力的测定
1.在液体培养基中细胞或小细胞团分散性好，而小细胞团也仅在几十个细胞以下
2.均一性好。细胞形状、大小以及细胞团的大小表现均一致
3.生长迅速。细胞分裂旺盛、生长迅速，一般2-3天繁殖1倍
一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个基本条件
植物悬浮细胞系是原生质体培养和人工种子的研制奠定良好基础
为遗传转化提供了良好的受体
也可以用来生产植物次生代谢产物
植物悬浮细胞系的作用
建立良好悬浮细胞系应具备的条件--同步化
选择适合的基因型和外植体
选择合适的细胞悬浮培养基
一个成功的悬浮细胞培养体系必备的三个基本条件：细胞或小细胞团分散性好、均一性好、生长迅速
细胞悬浮培养过程中要注意细胞与培养基的比例，以120转/分下细胞可在培养液中浮起为宜；新配好的培养基应放置几天再用
细胞悬浮培养
一个是直接形成体细胞胚；另一个是先形成肉眼可见的愈伤组织，通过愈伤组织进一步再生植株，这种途径较常见
悬浮细胞的分裂和分化通常有两个途径
将制备好的细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm厚的薄层固体培养基上进行培养的方法
易于在显微镜下进行跟踪细胞分裂和细胞团形成的观察，便于细胞突变体的筛选
优点
平板培养的基本技术
1.选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是能够在低的初始植板密度下使细胞生长
2.不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分裂旺盛时期的细胞才有最高的植板率
3.在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种类而不同。如：烟草细胞适宜的为0.005-0.01个/毫升，若低于此数则植板率显著下降
4.接种时培养基的温度要控制，一般不超过35摄氏度
5.细胞密度的调制方法：若悬浮液中细胞密度高，则加培养液稀释；若悬浮液中细胞密度过低，则通过离心使细胞沉淀后，取一定量的上清液使其达到所要求的密度
平板培养必须注意
平板培养
有些植物细胞一旦被分离出来后，很难进行分裂和增殖，很可能导致死亡。因此，在悬浮细胞培养过程中用一块愈伤组织来哺育细胞，促使其进行分裂和增殖的培养方法
看护培养法技术
1.看护愈伤组织处于活跃生长状态；2.愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也可以不同
看护培养的要求
效果好，易于成功、简便易行、不能在显微镜下观察细胞的生长过程
看护培养的特点
要得到单细胞系必须保证接种材料是真正的单细胞
看护培养
人工制造一个小室，将悬浮细胞培养在小室中少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法
可以在显微镜下跟踪观察细胞分裂增殖形成的全过程
培养基少，营养和水分难以保持；pH值变动幅度很大；培养细胞仅能进行短期分裂
缺点
微室培养
也叫双层滤纸培养，Horsch等（1980）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法
条件培养
液体浅层培养
悬浮细胞的培养方法
机械法
酶解法
获取单细胞的方法
悬浮细胞愈伤组织的形成和植株再生
建立良好悬浮细胞系的技术关键
第一节 植物细胞悬浮培养体系的建立与植株再生
植物次生代谢产物的概念是在1891年由Kossel明确提出的，是由植物次生代谢产生的一类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素等，其产生和分布通常具有种属、器官、组织和生长发育期的特异性
酚类化合物
含氮化合物
根据分子结构的不同可以分为
1.直接从植物中提取次生代谢产物
2.利用化学合成的方法
3.微生物发酵
4.植物细胞培养法
5.基因工程技术
6.利用发根农杆菌遗传转化获得毛状根生产次生代谢产物
植物次生代谢产物生产途径
可以通过生物反应器进行大规模生产，实现生产工业化，提高次生代谢产物产量
由于采用生物反应器的生产系统和回收工艺，可以确保产物长期、连续和均匀的生产，不受天气、地理和季节等自然条件的限制
所获得的次生代谢产物的分离与纯化步骤要比直接从植物体内提取简单
可以通过细胞筛选，寻找原植物体内没有的其他有效成分
植物细胞生长缓慢，代谢产物含量低，成本高，而阻碍了植物细胞培养法在次生代谢产物生产上应用
利用植物细胞培养法生产植物次生代谢产物的优缺点
高产细胞系的筛选
培养基的优化
代谢调控
诱导子
实现植物细胞培养生产次生代谢产物规模化生产的前提和关键
两步培养法
两相培养法
固定化培养法
生物转化是指以植物培养细胞为酶源，使某种前体化合物生成相应产物的技术，也叫植物细胞转化
生物转化
通过植物细胞培养技术生产次生代谢产物的方法有4种
第二节 植物细胞培养与次生代谢产物生产
第八章
长期保存濒临灭绝和具有重要经济价值的植物种质资源
长期保存农作物的优良品种及其育种亲本的种质
建立长期保存的茎尖分生组织种质库及无病毒的原种
无性繁殖植物种质的长期保存与快繁相结合保存实验材料，防止再培养中遗传变异
为什么学习植物细胞培养物等的超低温保存？
超低温保存（Cryopreservation)是离体保存和低温生物学结合的产物，是指建立在离体培养技术基础上，在-80~-196摄氏度，甚至更低温度环境中保存生物或种质资源的一套生物学技术
一、超低温保存的概念
1.细胞预冻；2.细胞在-196摄氏度下长期贮存；3.细胞解冻
细胞超低温保存有三个重要操作步骤
二、超低温保存的细胞学基础
冷冻诱导保护性脱水的超低温保存的方法，有冰晶的形成
1.常规超低温保存法
是Sakai等（1990）建立的一种简单高效的冰冻保存方法，是将生物材料用一定配方的复合保护剂在25或0摄氏度处理一段时间后，随即投入液氮保存的方法
将高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下凝固，形成不规则的玻璃化样固体，保存了液态时正常分子和离子分布，因而在细胞内部发生玻璃化时能起到保护作用
基本原理
就是使细胞本身及冷冻溶液在冷冻时，呈现黏稠而不产生结晶的玻璃化状态，利用这种不结冰的原理以改善慢速冷冻的缺点
2.玻璃化法--不形成冰晶
3.滴冻法
是在滴冻法和玻璃化法基础上发展起来的用于植物种质资源保存的新技术，即用装载液及玻璃化液对材料进行处理，而后将材料放在含有玻璃化液滴的铝箔纸上并投入液氮冻存的一种高效超低温保存方法
4.小滴玻璃化法
三、超低温保存的方法
第一节 植物细胞培养物和组织与器官超低温保存的概念与细胞学基础
用于组织培养的全套设备、普通电冰箱、-60~-80摄氏度的低温冰箱、程序降温器、装材料的玻璃或塑料试管、液氮罐、光学显微镜和紫外光荧光显微镜、分光光度计
一、主要仪器设备
二、基本程序
植物材料的选择
预培养的目的是提高分裂细胞的比例，减少细胞内自由水含量，增强细胞的抗冻能力
1.增加预培养基中的糖浓度，提高渗透压，以减少细胞内自由水含量
2.在预培养基中加入诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂，如山梨醇、蔗糖、丙二醇、DMSO、脱落酸等，是目前应用最广泛的一种预处理方法
材料预培养的方法包括
材料的预处理
保护剂的作用机制是增大膜对水分的通透性，促进细胞外冰冻造成的脱水效果，降低细胞内水分冰点温度，保护蛋白质和酶类
一类是能穿透细胞的低分子量化合物（DMSO）以及各种糖类等；DMSO是广泛采用的一种，Sakai较详细的研究了DMSO的使用浓度，认为其较适宜的浓度为5%-10%
另一类是不能穿透细胞的高分子量化合物（如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯二醇）
常用的冰冻保护剂大体分两类
冰冻保护剂
1.快冻法是将材料从0摄氏度或其他预处理温度中直接投入液氮内
2.慢冻法：慢冻是指以0.1-10摄氏度/分钟的降温速度从0摄氏度降到-100摄氏度左右再立即浸入液氮
3.逐级冰冻法：培养物预冷却到-20、-50、-70、-100摄氏度停留一段时间后浸入液氮中
4.干冻法：采用无菌空气流、干燥硅胶或饱和溶液表面的气相等对材料进行脱水处理后快速将材料投入液氮贮存
5.玻璃化法：是由Sakai等建立的一种简单高效的冰冻保存方法
6.包埋玻璃化法：是将植物材料用褐藻酸钙包埋后，先在含高浓度蔗糖的培养基中脱水，再用无菌空气流或干燥硅胶脱水，然后投入液氮中保存，若用玻璃化保护及辅助脱水
7.小液滴玻璃化法
降温冰冻方法
大量的实验表明，快速化冻法对大多数植物材料都适合，通常的做法是：将冻存后的材料放在25-40摄氏度的水浴中解冻，一旦冰完全融化后，立即取出材料以防热伤害和高温下保护剂的毒害
1.植物超低温保存影响因素很多，想用一种方法或体系保存不同的植物组织培养物不一定可行，尚须根据材料的特性，研究并建立与之相适应的保存体系的方法
2.种质保存的目的在于保持遗传基因稳定性，所以，应跟踪成苗的植物生长状况和遗传稳定性，加强超低温保存后遗传性状的分析
3.从分子水平上分析冻存的机制，建立一套操作简便、行之有效的冰冻保存方法
注意的问题
化冻方法
三、影响因素
第二节 植物细胞超低温冻存的影响因素
第九章
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