胶体金试剂生产工艺简述思维导图模板

制备HIV诊断抗原

抗原用基因工程表达，再经纯化制备

gpl60

gpl2O

gp41

gp36

抗原特征

标记蛋白的分子质量最好在35 kDa以上

纯度在95％以上，才能达到较好的特异性

较好的稳定性，抗原在标记过程中需经历pH变化、离子强度变化和干燥过程，在这些变化中要求蛋白质的抗原性不失活

标记和包被抗原具有很好的配对关系

配对关系指在一组标记和包被抗原中，两个抗原配合能产生的较高的灵敏度和特异性。好的配对要求具有相同的抗原决定簇，并且标记抗原和抗体结合后，形成的复合物有很好的位点能再和包被抗原结合。

抗原是否具有良好的配对一般只能在实际研制中筛选和确定。

制备胶体金溶液

胶体金是氯金酸与还原剂（如柠檬酸钠）反应形成带负电的疏水胶体溶液，反应过程颜色变化是浅黄色-透明-黑紫色-紫红色，控制氯金酸与还原剂的比例可以得到不同粒径的胶体金溶液

胶体金溶液按氯金酸一还原法制备

在三角烧瓶加入1OOml去离子水和1m11％的氯金酸溶液

将溶液煮沸后，快速加入1 ml左右的1％柠檬酸三钠溶液

氯金酸在加入柠檬酸三钠后，被还原为金原子，金原子颗粒相互聚集形成胶体金颗粒，在这一过程中，要求容器和水等非常干净，因为任何杂质或离子都可能干扰金原子的聚集过程，得不到理想大小或形状的胶体金颗粒。

继续煮沸数分钟，冷却后即为胶体金溶液

HIV抗原标记的胶体金最好在3O～40nm，以利于标记

胶体金颗粒大小可以用电镜检验，也可用分光光度计检测

30～40nm的胶体金在530nm波长处有最大吸收峰

选择合适的辅料

NC膜及上样垫

NC膜为包被抗原的固相载体

目前市场基本上被德国Sartorius、美国Millipore 和印度MDI三家占领

不同厂家的NC膜在细节上可能具有一定的差异，并可能对抗原抗体反应有一定的影响，所以在制备过程中，应该先制备小样，对不同的膜进行筛选，以找出最合适的NC膜

原料在包被到NC膜上之前需要稀释到合适的浓度，包被的稀释液相对来说较为简单一些

PB或者PBS缓冲液最为常用，这两者的缓冲体系对包被的抗原抗体都有较好的适应性

当然为解决某些特殊异常还会添加一些化学试剂

如添加海藻糖和蔗糖是为了保持良好的稳定性

TWEEN 20和EDTA是为了减轻部分反白现象

BSA和Casein作为封闭剂对膜进行封闭等

上样垫是加样血清、血浆或全血载体，一般为玻璃纤维膜或聚酯膜等

要求有一定的液体承载量，本身不吸附蛋白质，为惰性材料，不释放干扰免疫反应的物质。

在产品的优化过程中，上样垫上往往要加上一定的封闭剂、表面活性剂或缓冲剂等，以调节抗原抗体反应。

制备全血试剂时，上样垫上还需添加滤血膜，或用特定的阳离子试剂处理，以阻止红细胞的层析，加速其凝集。

胶体金垫作为标记好的胶体金的载体，选择标准和上样垫基本相同。吸样垫一般选用吸水滤纸。

样品垫

分离过滤样品中的杂质，对样品进行前处理，平衡待测试样品的PH和调整盐离子强度，使样品在层析过程中保持一定的均一性和可控性

玻纤

Ahlstrom的8964玻纤较为常用

无纺布

滤纸

一般需要经过前期处理才能使用

处理液

一般包含

缓冲液

Tris

硼砂

磷酸盐缓冲液

表面活性剂

TWEEN 20

TRITON X-100

Tetronic 1307

其它生物原料

加入聚乙烯吡咯烷酮增加亲水性

BSA、异嗜性抗体和酪蛋白可以特异性吸附杂蛋白，降低可能出现的假阳性

EDTA可以减少轨线和消除部分反白作用

处理液还需要加入防腐剂叠氮钠或Proclin-300，最后调节一个最合适的PH然后处理在玻纤上，烘干即可

胶体金垫

标记垫是胶体金颗粒附着的载体，有些试纸条没有标记垫，将标记物直接点在样品垫上或者NC膜上也能满足要求，从精益的角度，少一种物料能省下很大量生产成本

具备非特异性吸附力低、标记物复溶和释放力好的材料可用于标记垫

聚酯膜

芬兰Ahlstrom的6613聚酯膜较为常用

玻纤

无纺布

吸样垫

基本上都是选用滤纸，选择要求不高，有良好的亲水性和保水性即可

底片材/背衬

主要是承载和黏合其它物料

底片材的选择要求不高，只要别粘性不好导致玻纤脱落或者太薄加烘后变形就好

也有些试纸条没有底片材

只要能将其它物料组合在一起就OK

对于无背衬的NC膜，在做加速稳定的实验时，底片材的胶有可能会渗入NC膜，导致C/T线出现一条很明显的黑线

解决办法是更换有背衬的NC膜或者更换原料点膜缓冲液

HIV抗原的胶体金标记

蛋白质和胶体金在一定条件下的结合称为标记

用烧杯取一定量的胶体金溶液

于磁力搅拌器上缓慢搅拌

缓慢加入适量的HⅣ抗原

继续搅拌30～120分钟

加入PEG、BSA或其他封闭剂后，高速离心

将胶体金沉淀溶于保存液(工作液)中备用

胶体金工作液是涉及产品质量的一个重要环节。工作液有

工作液是一个缓冲系统，为以后的反应提供合适的pH和离子强度

工作液需加人BSA等封闭剂，以克服检测时的非特异性反应

稀释液中需加入一定的表面活性剂，以增加胶体金反应时的流动性，并调节免疫反应强度

需加入糖类物质或其他稳定剂，以保护标记胶体金的稳定性。一个好的胶体稀释液需要精心调试，才能达到理想效果<br>

胶体金标记受较多的因素影响

pH

pH影响体系中蛋白质或胶体金的带电性，即影响结合力

根据经验，HIV抗原的      标记一般在偏碱的环境下标记为宜。

离子强度

较高的离子强度会破坏胶体金溶液的稳定，使胶体金聚集沉淀

所以蛋白质标记前一般需用低浓度的磷酸缓冲液(PRS)等透析以去除离子

标记蛋白质的量

由于不同的HIV抗原免疫活性不同，需要调节到合适的量以达到最佳的标记效果

一般1m1胶体金加入的抗原量在5～20ug

金颗粒是一种特别娇贵且有洁癖的微球，标记过程使用的器皿一定要保证足够干净

选择合适的PH体系，胶体金颗粒与蛋白原料结合

标记前一定要确定最佳的PH体系，一般选择在略高于蛋白质PI，PH不合适很容易导致死金

蛋白原料的加入需要提前稀释

高浓度的原料直接加入胶体金溶液也很容易死金

也可以尝试反过来加，将胶体金溶液加入到原料中

针对某些重组抗原难标记，可以使用抗体搭桥标记，先标记一个重组抗原的标签抗体，然后再与重组抗原结合

加入封闭剂对胶体金表面未与特异性蛋白结合的位点进行封闭

高速离心浓缩胶体金溶液，最终的溶液OD值控制在130上下

最后去上清，加入适量保存液保持即可

题外话：乳胶标记

乳胶产品与胶体金产品除了标记物有区别外，其它基本上一致

乳胶颗粒

物理吸附

化学偶联颗粒

使用EDC活化的一步法

使用EDC+NHS活化的两步法

针对不同原料需要选择不同粒径的颗粒和使用不用的封闭剂以及反应体系Buffer和PH

标记胶体金干样制备

胶体金标记完成后，需要将标记胶体金制成干样

一般将标记好的胶体金用工作液配成5％～2O％的溶液

再滴加或用专用的喷金仪喷到胶体金垫上

在干燥间干燥后保存备用

HIV抗原

包被

用专用的划(喷)膜仪将抗原蛋白划(喷)到NC膜上，干燥，使抗原牢固结合在膜上的过程

抗原包被量也是需要优化的过程，过高或过低都会影响试剂最后的灵敏度和特异性

HIV抗原的包被浓度一般在O.5～2mg／m1

包被时所用的抗原稀释液一般是PBS或其他低浓度的缓冲液，有时需加入乙醇、糖或BSA等，以调节抗原在膜上的扩散性和稳定性

抗原包被到膜上经干燥后，会牢固结合在膜上不被洗脱，这种机制目前还不完全清楚

干燥后的膜保存备用

视不同厂家生产工艺的不同，有时需要包被好的膜浸入含BSA、酪蛋白或其他封闭剂的溶液中进行封闭后，再做下一步使用

贴膜

切割

产品的内外包装

试剂条结构

样品垫+标记垫+NC膜+吸收垫

无标记垫结构

将标记物处理在NC膜上或者样品垫上就可以省去标记垫

处理在NC膜上胶体金可能比较少，乳胶会多一些，使用这种结构灵敏度会弱一些，标记物释放没有那么完全，建议对灵敏度要求不是特别高的或者灵敏度已经满足要求的可以尝试一下

双标记垫结构

常见于多对原料产品

比如HIV和Flu A&B，HIV包括Ⅰ型Ⅱ型和O型，因涉及到多种亚型，使用的原料比较多全部处理在同一标记垫上可能相互会产品影响，影响产品性能，这时候可以选择双标记垫结构

有些产品因标记物释放的影响，双标记垫结构一般比用相同使用量的单标记垫灵敏度会高一些。

不过这种结构会对后期生产增加难度，处理不当标记垫容易脱落

桥垫结构

桥垫结构是在样品垫与标记垫之间加一段连接垫

对于样品垫投放了反应原料的产品，桥垫可以使样本与样品垫上的原料反应更加充分，提升产品性能

对于样品垫未投放反应原料的产品，桥垫可以减缓样本流速，有助提高产品灵敏度

桥垫的材料与样品垫一样

主要是滤纸、玻纤和无纺布，也可以尝试一下聚酯膜，桥垫也需要使用处理液进行处理

金标垫反粘结构

金标垫反粘是将喷金的那一面朝下粘在底片材上

结构的目的是为了降低金标的释放速度，提高某些产品性能