Xenium Protocol for FFPE
2023-04-23 15:33:03 0 举报AI智能生成
Xenium Protocol In Situ Gene Expression
作者其他创作
大纲/内容
<span style="font-size: inherit;">FFPE</span><br>
制备FFPE蜡块（<font color="#569230">客户端制备</font>）
<span style="font-size: inherit;">可以进行相应组织块粗修</span><br>
组织块比样本区域小，不用粗修
组织块大于样本区域但组织小于样本区域，可以修建组织周围石蜡<br>
组织块和组织大小都大于样本区域，组织周围的石蜡可以被修剪，组织可以被分成更小的切片以适应样本面积<br>
切片和贴片
Face the Block and Rehydrate
切开组织块，暴露组织
冰浴重新水化
Section the block
Float Section in water bath<br>
Place section on the slides<br>
Blank Slides
空白切片要求75*25*1 大小
Xenium Slides
过夜干燥后，进行后续脱蜡、解交联，含FFPE的slides<font color="#e74f4c">常温干燥箱中保存4周</font><br>
未拆封保存在-20
拆封后常温干燥箱保存1周<br>
如果同一切片中贴多个组织，确保之前的组织不再淹没在水中<br>
Deparaffinization and H&E Staining Imaging（QC）<br>
tissue quality QC
脱蜡和解交联
Deparaffinization脱蜡
脱蜡流程
烤片2小时，室温冷却7min后，可以进行<font color="#e74f4c">拍照</font>，以便后续排查是否有脱片。<br>
烤片后可以进行拍照，以便后续排查是否有脱片。
脱蜡最后，将slide组装于卡夹中
正确的组织卡夹，也是很重要
卡夹组装<br>
Decrosslinking解交联
加入解交联试剂进行22度孵育前，<font color="#e74f4c">安装卡夹盖子</font>，然后盖上PCR仪再进行孵育。
去除解交联试剂后，进行3次PBS-T清洗，最后再加一次PBS-T
解交联后可以进行<font color="#e74f4c">拍照</font>，以便对比组织形状判定是否有脱片<br>
<font color="#5b79e8">如果只有1个正式芯片，在所有需要进行关闭热盖进行孵育的程序时，可以组装一个空白切片进行平行孵育。</font><br>
解交联后<font color="#e74f4c">立即</font>进行探针杂交
探针杂交、连接和扩增（FF与之相同步骤）
探针杂交
预设探针only
人乳腺癌或是小鼠脑
预设探针+定制探针（不能单添加定制探针）
去掉一部分稀释buffer，与预设探针等体积添加即可
记录定制探针的ID 和相应slide NO.<br>
热盖50℃或是关掉热盖
杂交16-24 h
杂交后清洗<br>
取下卡夹，去掉盖子，去除杂交mix试剂<br>
如果有2个slide，先去除并添加试剂，再做第2个，避免slide干燥。<br>
立即加入500 ul PBS-T,室温孵育1min。去除PBS-T试剂
不要引入气泡
小气泡没有关系，不要吸或是戳破小气泡，容易导致脱片或是损失样本<br>
重复上一步 1次
加入500ul杂交后清洗buffer，盖盖并上PCR仪 37℃孵育30min
结束后立即进行下一步
连接
取下卡夹，去掉盖子，去除清洗buffer试剂
如果有2个slide，先去除并添加试剂，再做第2个，避免slide干燥。<br>
立即加入500 ul PBS-T,室温孵育1min。去除PBS-T试剂
重复上一步2次<br>
加入500ul 连接mix，盖盖并上PCR仪37℃孵育2h<br>
结束后立即进行下一步
扩增
取下卡夹，去掉盖子，去除连接mix试剂
如果有2个slide，先去除并添加试剂，再做第2个，避免slide干燥。<br>
立即加入500 ul PBS-T,室温孵育1min。去除PBS-T试剂
重复上一步2次<br>
加入500ul 扩增mix，盖盖并上PCR仪30℃孵育2h<br>
扩增后清洗
取下卡夹，去掉盖子，去除扩增mix试剂
加入500 ul TE,室温孵育1min。去除TE
重复上一步1次
加入500 ul TE
进行下一步或是保存
进行下一步<br>
安全停靠点：盖上盖子，4℃过夜或是不超过4天保存<br>
保存期间，不要开盖
自荧光淬火<br>
目的：减少由于醛固定、红细胞以及胶原蛋白/弹性蛋白结构造成的自发荧光
取下卡夹，去掉盖子，去除TE<br>
如果有2个slide，先去除并添加试剂，再做第2个，避免slide干燥。
加入1000ulPBS,室温孵育1min，去除PBS<br>
再重复上述步骤2次
500ul加入 稀释过的Reducing Agent B，盖盖，室温孵育10min。
取下卡夹，去掉盖子，去除Reducing Agent B<br>
加入1000ul 70%乙醇，等1min，弃掉。<br>
加入1000ul 100%乙醇，等1min，弃掉
重复上一步1次
立即加入500ul Autofluorescence Solution ，盖盖，<font color="#e74f4c">黑暗条件</font>下室温孵育10min<br>
去掉盖子，去除Autofluorescence Solution
加入1000ul 100%乙醇，等2min，弃掉<br>
再重复上一步2次
将卡夹放置于PCR仪上，进行37℃ 5min烘干，卡夹不盖盖子同时PCR仪不盖盖。<br>
不要干透
<font color="#e74f4c">立即</font>取下卡夹，并加入1000ul PBS重新水化组织，并<font color="#e74f4c">黑暗条件</font>下室温孵育1min。去除PBS<br>
加入1000ul PBS-T，<font color="#e74f4c">黑暗条件</font>下室温孵育2min<br>
可以进行拍照，以便对比组织形状判定是否有脱片<br>
保存或继续进行<br>
保存：安全停靠点，盖上盖子，4℃黑暗条件下保存不超过4天
保存期间，不要开盖
继续实验（推荐继续）
核染
去除PBS-T，加入500ul Xenium Nuclei Staining Buffer，<font color="#e74f4c">黑暗条件</font>下室温孵育<font color="#e74f4c">1min</font><br>
去除Nuclei Staining Buffer，加入1000ul PBS-T，<font color="#e74f4c">黑暗条件</font>下室温孵育1min
再重复上一步2次
加入1000ul PBS-T，保存或继续<br>
保存：安全停靠点，盖上盖子，4℃黑暗条件下保存不超过4天
保存期间不要开盖
继续进行实验<br>
什么核染染料？
解码和拍照分析（FF与之步骤相同）
DAY1
解冻解码试剂
Decoding Module A
实验前密封袋中4度过夜解冻（氧敏感）
实验前密封袋中4度过夜解冻（氧敏感）
未拆封的A 试剂，4度最多保存3天<br>
从包装中取出后5天内必须使用（含运行时间）<br>
从4度取出后，轻柔反转20次混匀来进行混匀，不要震荡，然后冰上保存。<br>
准备空板，加水制备配平板，±1g的波动<br>
300g 室温离心1min
离心完后上机前，一直4度保存直到loading<br>
Decoding Module B
实验前密封袋中4度过夜解冻
从4度取出，室温平衡30min<br>
从4度取出后，轻柔反转20次混匀来进行混匀，不要震荡，室温保存。
准备空板，加水制备配平板，±1g的波动
300g 室温离心1min<br>
离心完后上机前，一直常温保存直到loading
DAY2
准备buffer
Deionized Water/Xenium Instrument Wash Buffer
Milli-Q Water
500ml
Xenium Sample Wash Buffer A
不要用磁力搅拌器或是剧烈摇匀<br>
保证最小的气泡
PBS + Tween（粉末或是液体）
1L
Xenium Sample Wash Buffer B
Milli-Q Water
500ml
Xenium Probe Removal Buffer
DMSO + Tween + KCl
不要用磁力搅拌器或是剧烈摇匀
保证最小气泡
300ml
设备初始化
按住右侧开关<br>
长按3秒以上
输入实验细节
屏幕上点击Start New Run”
机器自检3min<br>
输入 Run Name 、Cassette Name、Slide ID、Panel File<br>
设备加载
加载各项耗材
检测各项准备是否完成（√）
卡夹（贴好组织的 Xenium slide）<br>
试剂buffer 瓶（装有buffer并盖上专业的盖子）<br>
Objective Wetting Consumable<br>
Reagent Plate
Pipette Tip Rack<br>
Extraction Tip
废枪头盒
样本扫描（1h）
初始扫描用于区域全选
确保远离震动
确保不与设备发生相互作用，不触碰键盘或是触摸板
圈选和启动运行
点击添加区域按钮
区域选择
区域大小：最小为1个FOV，最大为整个区域
每个slide至少选择1个区域
每个组织都是单独的区域
如果大于8个区域，建议合并为1个区域。高数目的区域会增加运行时间<br>
如果不确定FOV是否属于一起，需要选择所有位置作为一个区域<br>
一个区域内FOV不一定是连续的
不能允许出现overlap的情况，如果有则需要两个区域中排出掉重叠区域。<br>
圈选的原则
DAY4-6
运行
确保耗材全部在位
确保远离震动<br>
点击 Start Run
界面4色颜色状态
蓝色：运行中
绿色：运行结束
黄色：运行未完成<br>
红色：运行失败
运行后清洁
点击启动“Cleanup”<br>
结束后，点击“Continue”
卸载
打开机器前面面板
移除所有耗材并切掉所有的固体和液体的垃圾
弃掉耗材无需按照相应顺序
H&E染色（post Xenium RUN）
可选
FF
收藏
职业：PM-本科
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