雷帕霉素和torin1处理后能够显著地在过度活跃的mTORC1信号传导诱导MXD2的mRNA水平
通过敲低eIF4A/4B验证m6A writer 复合体中与eIF4A/4B相关的部分为WTAP
A:mTORC1通过m6A修饰调控MXD2
使用qPCR验证这些基因在TSC2缺陷细胞中的mRNA水平变化：（1）用torin1处理验证mTORC1依赖性和（2）敲低METTLE14、METTLE3、WTAP验证m6A依赖性
Q4：mTORC1调控的m6A有什么样的生物作用
torin1不影响consensus motif，也不影响转录本上的m6A
是否有mTOR引起转录本上m6A修饰位点的改变
回顾m6A-seq、全转录本的m6A水平，再通过torin1处理结果得到m6A修饰会导致mRNA不稳定，反之亦然
Q1. 是否mTOR能够调控mRNA的化学修饰
A:MXD2-cMyc信号传导是mTORC1和WTAP依赖性细胞生长的关键效应因子
mTORC1 promotes cell growth via m6A-dependent mRNA degradation
用mTORC1特异抑制剂雷帕霉素验证mTORC1对WTAP表达有影响
mTORC1有可能通过提高WTAP水平导致m6A结构的形成以及特殊的转录本降解促进细胞的生长和增殖
1.使用GO分析显示过半的基因富集在细胞大分子的代谢过程2.其他的细胞功能则富集在蛋白O-糖基化修饰、蛋白靶向、基因沉默
Q5：深入探索mTORC1通过m6A修饰调控的基因带来的影响
A：mTOR与m6A的水平有关
Q2：mTOR调控m6A甲基化修饰的分子机制
有18个基因的mRNA水平在三种条件下显著的增多
敲低WTAP抑制了insulin导致的m6A水平升高
生成无氨基酸序列变化的m6A motif突变导致的MXD2突变体，和wt MXD2相比，突变体不会被雷帕霉素或torin1影响
使用eIF4A的小分子抑制剂辅助证明eIF4A/4B对于WTAP的蛋白水平的促进作用
mTORC1-S6K通过促进募集eIF4A/4B到翻译起始前复合物使WTAP高度结构化的mRNA 5'UTR开始翻译
A:mTORC1-S6K通过eIF4A诱导WTAP的蛋白表达
进一步验证在体内环境mTOR调控WTAP的作用
催化不活跃的METTL3突变体增加了MXD2 的表达量
敲低WTAP的细胞中，cMyc靶基因的表达降低
A:mTORC1-S6K轴调控WTAP的表达
WTAP敲低后，具有过度活化的mTORC1信号传导的癌细胞增殖减少
从WTAP的mRNA水平验证
转录抑制或5-乙炔基尿苷标记评估MXD2的mRNA水平，雷帕霉素和torin1增加了MXD2额的稳定性
敲低WTAP降低了cMyc与MAX的关联，伴随着MXD2-MAX结合的增加，同时靶基因启动子中cMyc的占有率降低
敲低S6K1/2，WTAP的表达量减少，相反地S6K1-CA则抑制了雷帕霉素对WTAP的负影响
对比mTORC1和mTORC2调控WTAP
先前m6A-seq中候选基因中cMyc，mTORC1通过调控m6A修饰cMyc的抑制物MXD2来影响cMyc
使用雷帕霉素后，WTAP和pS6的水平都下降了
MXD2敲低改变了该趋势，和cMyc的表达
敲低YTHDF2/3后促进MXD2表达，
Q3：mTORC1-S6K是调控WTAP的机制
mTOR激活促进了mRNA的m6A修饰
替换内生的METTL3-14，表达wtMETTL3、14，MXD2水平被抑制
异位表达的WTAP抑制了torin1诱导的MXD2的表达
计算分析来预测WTAP的初级RNA结构
1.通过测量WTAP mRNA 的上的多聚体数量变化验证翻译效率2.敲低eIF4A会导致mRNA向着聚合化更少的片段发展，表示WTAP的翻译被抑制了3.对照组PPIB的mRNA检测结果则无变化
给予torin1或mTOR siRNA后，WTAP表达量下降
发现WTAP的结构特征类似于eIF4A/4B的一些目标作用基因
敲低WTAP后MXD2的表达量升高，给予胰岛素后又降低
构建TSC2缺失鼠模型鼠，WTAP的表达量明显上调
使用torin1抑制m6A水平的基因
m6Awriter复合体中只有WTAP在胰岛素刺激后上调
为验证该可能性，检查了m6A水平与mRNA水平趋势相反的基因
mTORC1能在多种癌细胞系中抑制MXD2
Q6：探究mTORC1-WTAP-MXD2信号轴对cMYC活性和细胞生长的影响
MXD2敲低则改变了这种现象
insulin刺激细胞12h后m6A水平上升
耗竭WTAP没有显著抑制TSC正常的LAM细胞生长
A：mTORC1的活性是WTAP表达所必须的
