省自然--硫胺素2

确定REV-ERBα的下游靶向基因

REV-ERBα与NF-κB/NLRP3的关联性

原代细胞分离培养

靶点解析

试验二：细胞水平研究炎症反应抑制“生物钟”的机理，验证REV-ERBα/NF-κB/NLRP3的表达模式

功能验证

JTK_CYCLE拟合

生物钟核受体REV-ERBα对SARA诱发的山羊瘤胃上皮炎症的作用及调控机制是什么？

Western Blot

ELISA

鲎实验法

血液及瘤胃液中LPS的浓度节律性

试验三：细胞水平揭示生物钟核受体REV-ERBα通过抑制NF-κB/NLRP3途径缓解瘤胃炎症的调控机制

试验一：动物水平确定“生物钟”与瘤胃炎症的关联性，研究REV-ERBα/NF-κB/NLRP3的表达模式

REV-ERBα/NF-κB/NLRP3的表达模式

生物钟及炎症因子基因的相关性；明确关键时间点

低精料日粮组（n=12）NFC/NDF=1.10

生物钟及炎症关联途径REV-ERBα/NF-κB/NLRP3的表达模式

JTK_CYCLE节律性分析

EMSA

高精料日粮组（n=12）NFC/NDF=2.30

偏相关性分析

屠宰后采集瘤胃上皮组织

构建过表达质粒

基于LPS建立ZT0~ZT24等7个时间点的瘤胃上皮细胞炎症模型

生物钟相关蛋白的表达水平

qPCR

关键时间点瘤胃上皮细胞炎症模型

REV-ERBα对于NLRP3启动子的调控机理

Pearson或Spearman相关性分析

ChIP-PCR

荧光素酶报告基因

生物钟及炎症因子基因的表达模式

启动子调控

CRISPR-Cas9

CT0~CT24等7个时间点采集血液及瘤胃液样本

血液及瘤胃上皮中炎症因子的浓度

明确SARA诱发的瘤胃炎症扰乱其内在“生物钟”系统的机理，阐明生物钟核受体REV-ERBα调控瘤胃炎症的作用机制；为牛羊瘤胃营养调控提供新的作用靶点

免疫组化

REV-ERBα对于p65启动子的调控机理