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生化实验B

2019-04-19 13:40:17   0  举报

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生化实验B期末考考核

作者其他创作

大纲/内容

考核方式

实验报告(40分）

理论（20分）

实验原理

操作注意事项

操作（40）

考试内容

实验1 酶的基本性质考察：影响酶活性的因素

实验原理

影响酶活性的因素包括：底物类型、酶浓度、底物浓度、产物浓度、抑制剂、激活剂、pH值、温度等

酶的特异性是指一种酶只能对一种或一类化合物（此类化合物通常具有相同的化学键）起作用，而不能对别的化合物起作用。如淀粉酶只能催化淀粉水解，对蔗糖的水解无催化作用

温度，酶作为生物催化剂，和一般催化剂一样呈现出温度效应，提高温度可以提高酶促反应速度，但另一方面又会加速酶蛋白的变性速度，所以在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。 酶反应速度达到最大时的温度称为酶的最适温度。酶的最适温度不是一个常数，它与作用时间的长短有关系

环境pH，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性，酶活性最高时的pH，称为酶的最适pH，高于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。不同酶的最适pH不同。酶的最适pH不是一个特征性的物理常数，对于一个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异

抑制剂和激活剂，能使酶活性增加的称为激活剂，能使酶活性降低的称为抑制剂。很少量的激活剂和抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性，但激活剂和抑制剂不是绝对的，浓度的改变可能使激活剂变成抑制剂

<ul><li>淀粉在淀粉酶的作用下被降解成单糖，这种降解过程是逐步进行的，降解的中间产物遇碘曾现不同的颜色： </li><li>淀粉 → 红色糊精→ 无色糊精 → 麦芽糖 → 葡萄糖 </li></ul> （紫蓝色）（红色）（无色）  <ul><li>根据水解液和碘反应的颜色，可以判断水解是否已完全 </li></ul>

还原糖的鉴定：Benedict反应

淀粉和蔗糖都没有还原性，但淀粉水解产物为葡萄糖，蔗糖水解产物为果糖和葡萄糖，均为还原性糖，能与Benedict试剂反应，生成砖红色的氧化亚铜沉淀

注意事项

唾液的稀释倍数因人而异，有时差别很大，稀释倍数可以是5～100倍

本实验中的酶反应时间是10 min，但实际是随不同的唾液淀粉酶的活性而变化的，所以在实验前先找出准确的保温时间是本实验的关键

加入酶液后务必充分摇匀，保证酶与全部淀粉溶液接触，反应才能得到理想的颜色梯度变化结果

实验2 底物浓度对酶活力的影响（碱性磷酸酶米氏常数测定）

实验原理

比色分析法

1.物质的颜色和波长 可见光：λ 400—760nm 紫外光：λ小于400nm 红外光：λ大于760nm

2. 溶液的颜色和光吸收的关系溶液的颜色，是由于有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深

3. 吸收光谱 • 红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.5-1000µm，主要用于有机化合物结构鉴定。 • 紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200-400nm，可用于结构鉴定和定量分析。 • 可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400-750nm，主要用于有色物质的分析

4. 分光光度法的主要研究方式 • 比较吸收光谱曲线 • 比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm 核酸的最大吸收波长为260nm • 比较吸光度的比值纯DNA: A260/A280=1.8

5.Lambert-Beer定律表达式为 其中：T为透光率，A为吸光度，I0为入射光强度，I为透射光强度。 e为摩尔消光系数，c为溶液浓度，l为溶液液程的厚度

米氏常数测定原理

米氏常数Km是酶的基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。Km 数值越小，酶和底物的亲和力越强；Km 值越大，酶和底物的亲和力越弱

测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的是Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：

以1/v对1/[S]作图，可得一条直线 分别确定直线在X轴和Y轴的交点数值，即可求出Vm和Km。由米氏方程可推导出米氏常数Km值的物理意义为反应速度V达到 1/2Vm时的底物浓度（即Km=[S]1/2Vm）

<ul><li>本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm </li><li>反应式：pNPP+H2O ——pNP+HPO42 </li></ul>                 无色                       黄色 <ul><li>可通过分光光度法测定产物对硝基苯酚pNP的含量，求出反应速度v  </li></ul>

注意事项

1.取液量一定要准确。  2. 反应时间一定要精确。  3. 加酶前后一定要将试剂混匀。  4. 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。  5. 测定A405时要以各自的空白调零点。  6. 移液管或移液器的使用 7. 比色杯的使用

实验3 血清转氨酶活性测定

实验原理

谷丙转氨酶（GPT）：丙氨酸氨基转移酶（ ALT）, 作用于L-丙氨酸和α–酮戊二酸之间的氨基转移作用

血清转氨酶活性，临床上可作为疾病诊断和预后的指标之一

利用丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙（在碱性溶液中呈红棕色），通过测定二硝基苯腙在480—530nm波长处的吸光度求得丙酮酸的生成量，以此测得谷丙转氨酶的活性。

国内采用的血清谷丙转氨酶比色测定法有三种，赖氏法、金氏法、改良穆氏法，三种方法主要的不同点在于其单位定义和标准曲线的绘制方法，因此测定结果的单位数值和正常值也不相同

赖氏法所规定的单位数是实验方法和卡门氏分光光度法作对比测定所得，比较准确

注意事项

<ul><li>若标本为健康人混合新鲜血清，空腹取血。应避免溶血，及时分离血清 </li><li>酶活性的测定结果与温度、酶作用的时间、试剂加入量等有关，操作时应严格掌握 </li><li>2,4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反应并非特异，α–酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼作用而显色，2,4-二硝基苯肼本身也有类似的颜色，因此空白颜色较深 </li><li>当测定结果超过150卡门氏单位时，应用生理盐水稀释后再测 </li><li> L-丙氨酸用量应减半 </li></ul>

实验4 血红蛋白的提取和分离+血红蛋白与高铁血红蛋白分子吸收光谱的绘制与比较

实验原理

血红蛋白成分

吸收光谱曲线

<ul><li>测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标、以吸光度为纵坐标作图，可得到一条曲线，即吸收光谱曲线或简称吸收曲线。 </li></ul>吸收光谱分为原子光谱和分子光谱。 <ul><li>原子吸收光谱是由原子外层电子选择性地吸收某些波长的电磁波引起的。原子吸收分光光度法就是依据原子的这种性质建立起来的，其吸收光谱显示为线状光谱。 </li><li>分子吸收光谱比较复杂，显示为带状光谱，这是由分子结构的复杂性所决定的。  </li></ul>

分子光谱产生的机理

分子由原子组成，原子中的电子围绕着原子核运动。化合物分子中的电子总是处于某种运动状态，而每种运动状态都具有一定的能量，相对应于一定的能级。分子中的电子受到光、热、电等的刺激时，其总能量发生变化，电子从较低能级转到较高能级，拥有了比原来高的能量，这一过程称为跃迁，分子也由基态转变为激发态。分子在吸收能量的过程中产生了吸收光谱。由于分子内部运动所涉及的能级变化复杂，因此分子吸收光谱也表现得比较复杂 所得到的分子吸收光谱由于谱线之间的波长间隔只有0.25 nm，几乎是连续的，其形状呈现为带状，故分子光谱为带状光谱

分子光谱用于物质定性分析的依据

不同结构的分子对光具有不同的吸收能力，有选择地吸收一定能量的光（一定波长的光），即分子对光的吸收具有高度的专一性。一定分子结构的分子只能吸收一定波长的光，因而不同物质具有不同的分子吸收光谱。这就是分子光谱可用于定性分析的理论基础。可以根据吸收光谱的形状和波长位置对被测物质进行基本判断

实验原理

<ul><li>氧合血红蛋白（HbO2）：血红蛋白（Hb）溶液在空气中充分接触氧气而形成的。 </li><li>碳氧血红蛋白（COHb）：CO结合在Hb中的亚铁原子上而形成的，呈樱桃红色。 </li><li>高铁血红蛋白（MHb）：高铁氰化钾在酸性或中性环境中，可使Hb中的亚铁离子失去一个电子，氧化成高铁离子而形成，呈棕色 </li></ul>

注意事项

血红蛋白提取

<ul><li>离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度 </li><li>观察所处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能较好除去血浆蛋白的原因 </li></ul>

血红蛋白与高铁血红蛋白分子吸收光谱的绘制与比较

<ul><li>每测一次波长，必需重新较正零点。 </li><li>气瓶总开关和减压阀都已开启并调好，不可再自行扭动，只需开、关两通上的活塞，按时间通入气体即可 </li><li>高铁氰化钾临用前配置，贮存于棕色瓶中 </li></ul>

实验5 凝胶过滤层析纯化血红蛋白

实验原理

凝胶层析（分子筛层析、排阻层析）是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同进行分离的技术

凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积称为外水体积（Vo），凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积（Vi）。 不能进入凝胶孔径的大分子，当洗脱体积为Vo时，出现洗脱峰；能全部进入凝胶的小分子，当洗脱体积为Vo+Vi时出现洗脱峰；介于其间的分子将在洗脱体积为Vo+Ve时，出现洗脱峰。

凝胶层析的优点

条件温和

操作简便

损失少，回收率高

层析柱可反复使用

注意事项

各接头不漏气、漏液，连接用的胶管无破损

装柱均匀，不过松，不过紧，流速不宜过快

始终保持柱内液面高于凝胶表面，防止凝胶变干

防止液体流干凝胶混入气泡，影响柱内液体流动

实验6 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血红蛋白

实验原理

移动方向：带电性质决定。蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动

泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度

影响泳动度的因素

颗粒本身

净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快

外界因素

电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等

不连续电泳的分离原理

1.电荷效应

各种蛋白质所带电荷不同，有效迁移率也不同

2.样品的浓缩效应

酸性蛋白质可解离出负离子，在电泳时向正极移动，Cl－速度最快(先导离子)，Glycine负离子最慢(尾随离子)，形成一个电导低、电位梯度陡的区域，导致蛋白质加快移动而被浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率

3.分子筛效应

蛋白质离子进入分离胶后，由于其pH升高(pH8.9)，使Glycine大量解离成负离子；同时胶浓度升高，蛋白质迁移率急剧下降，使Glycine的移动超过蛋白质，上述高电压梯度不复存在，蛋白质则按其电荷、大小和构型进行差异泳动，达到分离目的

4.SDS-PAGE

SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异，因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只与蛋白的分子量有关

注意事项

<ul><li>灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。 </li><li>加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。 </li><li>如加样孔界限不是很清晰，可在样品梳取出前用记号笔做上记号。 </li><li>电泳仪不能空载。 </li><li>电泳时不要用手接触电极缓冲液 </li></ul>

实验7 酮体代谢的检测+甲基百里香酚蓝比色法--测定血清钙

酮体代谢的检测

实验原理

<ul><li>酮体是乙酰乙酸、β-羟丁酸及丙酮3种物质的总称。 </li><li>酮体是脂肪酸在肝脏氧化分解时形成的特有中间代谢物，是在特殊情况下肝脏向外输出能源的一种特殊方式。 </li><li>酮体代谢的重要特征是肝内生酮肝外用 </li></ul>

以丁酸作为底物与肝组织匀浆(内含合成酮体的酶系)保温后，即有酮体生成。酮体可与显色粉(亚硝基铁氰化钠等)产生紫红色物质反应；而经同样处理的肌肉匀浆则不产生酮体，故无显色反应

测定血清钙

实验原理

血清中的钙离子在碱性溶液中与甲基百里香酚蓝（MTB）结合，生成一种蓝色的络合物。加入适量8-羟基喹啉，可消除镁离子对测定的干扰，与同样处理的钙标准液进行比较，求得血清总钙含量

注意事项

<ul><li>MTB与EDTA有相似的氨羧结构，能鳌合多种阳离子，但络合稳定常数不同。 </li><li>所用的试管清洗后用去离子水浸泡两次，再烤干备用。清洁管加入试剂后应显一致的浅灰绿色，若显蓝色则试管表示有污染。 </li><li>EDTA的用量选择，绝大部分金属离子与EDTA的络合稳定常数大于钙，小于钙的仅是少数微量元素。限量的EDTA仅能掩蔽试剂中的干扰元素，没有多余的EDTA络合血清钙，一般加入配试剂的EDTA浓度为99~108μmol/L，最终络合显色反应的EDTA浓度为50~54 μmol/L。 </li><li>加入EDTA的作用，目的在于掩蔽试剂中的污染的钙以及其他的金属离子。能降低空白管吸光度，提高测定管吸光度，从而使方法灵敏度提高。  </li></ul>

实验8 RAPI法提取组织（脑、肝、肾、肌肉）的蛋白+双缩脲法测定血清及组织总蛋白含量

实验原理

微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量

紫外分光光度法测定蛋白质浓度

双缩脲法测定蛋白质浓度

在碱性溶液中，双缩脲能与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比

蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此可以发生双缩脲反应，双缩脲法测定蛋白质范围约1-10mg

双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同

缺点是灵敏度较低

是临床测定血清总蛋白质首选的最方便、实用的常规方法

Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度

考马斯亮蓝染色法

BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）法

注意事项

1.吸光度须在显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 2.样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 3.分光光度计比色皿的使用要正确。 4.各试剂需用移液器准确量取。

实验9（考核实验）：血清肌酐测定

实验目的

1．学习和掌握碱性苦味酸法测定血清肌酐的原理。 2．掌握分光光度法测定血清肌酐的原理和实验技术。

实验原理

<ul><li>肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，每20g肌肉代谢可产生1mg肌酐。 </li><li>肌酐主要由肾小球滤过排出体外。 </li><li>血中肌酐来自外源性和内源性两种，外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物；内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。在肉类食物摄入量稳定时。身体的肌肉代谢又没有大的变化，肌酐的生成就会比较恒定。 </li><li>碱性条件血清样品中的肌酐与碱性苦味酸反应生成橘红色复合物，该反应为特异性反应，反应过程中形成的红色复合物与样品中肌酐的浓度成正比，可在波长500-520nm处进行测定。  </li></ul>

实验材料

器材

（1）电热恒温水浴锅 （2）紫外-可见分光光度计

试剂

（1）40mmol/L苦味酸溶液 （2）0.75mol/L氢氧化钠 （3）35mmol/L钨酸钠溶液（排除其它蛋白的干扰） （4）10mmol/L肌酐标准应用液 （5）10μmol/L肌酐标准应用液 （6）血清 （7）蒸馏水

实验步骤

（1）取试管一支，加入待测血清0.4ml，然后加入35mmol/L钨酸溶液4ml，充分混匀，3000r/min离心10min，取上清液备用

（3）颠倒混匀，放置37℃(若颜色未改变可设置为25℃试试)水浴10min，设定510nm波长，用分光光度计，以空白管调“0”，分别读取测定管与标准管吸光度，并取平均值

结果计算

样品管测试前的稀释倍数，（0.2ml样品加蛋白沉淀剂2ml则稀释11倍）

注意事项

1. 测定中，温度控制很重要， 10℃以下会抑制其反应，温度升高可使碱性苦味酸溶液颜色显色加深。 2. 呈色反应在30min内比色为宜，过久会使测定管吸光度增加。 3. 全血中含有大量假肌酐（如抗坏血酸，丙酮，乙酰乙酸等），测定时不宜采用全血