生化实验B

    酶的特异性是指一种酶只能对一种或一类化合物（此类化合物通常具有相同的化学键）起作用，而不能对别的化合物起作用。如淀粉酶只能催化淀粉水解，对蔗糖的水解无催化作用

    温度，酶作为生物催化剂，和一般催化剂一样呈现出温度效应，提高温度可以提高酶促反应速度，但另一方面又会加速酶蛋白的变性速度，所以在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。
酶反应速度达到最大时的温度称为酶的最适温度。酶的最适温度不是一个常数，它与作用时间的长短有关系

    环境pH，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性，酶活性最高时的pH，称为酶的最适pH，高于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。不同酶的最适pH不同。酶的最适pH不是一个特征性的物理常数，对于一个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异

    抑制剂和激活剂，能使酶活性增加的称为激活剂，能使酶活性降低的称为抑制剂。很少量的激活剂和抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性，但激活剂和抑制剂不是绝对的，浓度的改变可能使激活剂变成抑制剂

淀粉和蔗糖都没有还原性，但淀粉水解产物为葡萄糖，蔗糖水解产物为果糖和葡萄糖，均为还原性糖，能与Benedict试剂反应，生成砖红色的氧化亚铜沉淀

1.物质的颜色和波长
可见光：λ 400—760nm
紫外光：λ小于400nm
红外光：λ大于760nm 

2. 溶液的颜色和光吸收的关系溶液的颜色，是由于有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越 多，呈现的颜色越深

3. 吸收光谱
• 红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.5-1000µm，主要用 于有机化合物结构鉴定。
• 紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200-400nm，可用于 结构鉴定和定量分析。
• 可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400-750nm，主要用 于有色物质的分析

4. 分光光度法的主要研究方式
• 比较吸收光谱曲线
• 比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm 核酸的最大吸收波长为260nm
• 比较吸光度的比值 纯DNA: A260/A280=1.8

5.Lambert-Beer定律 表达式为
其中：T为透光率，A为吸光度，I0为入射光强度，I为透射光强度。 e为摩尔消光系数，c为溶液浓度，l为溶液液程的厚度

米氏常数Km是酶的基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。 特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。Km 数值越小，酶和底物的亲和力越强；Km 值越 大，酶和底物的亲和力越弱

测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的是Lineweaver-Burk双倒数作 图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：

以1/v对1/[S]作图，可得一条直线
分别确定直线在X轴和Y轴的交点数值，即可求出Vm和Km。 由米氏方程可推导出米氏常数Km值的物理意义为反应速度V达到 1/2Vm时的底物浓度（即Km=[S]1/2Vm）

• 本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm
  
• 反应式：pNPP+H2O ——pNP+HPO42
  

                 无色                       黄色

• 可通过分光光度法测定产物对硝基苯酚pNP的含量，求出反应速度v 
  

血清转氨酶活性，临床上可作为疾病诊断和预后的指标之一

• 测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标、以吸光度为纵坐标作图，可得到一条曲线，即吸收光谱曲线或简称吸收曲线。
  

吸收光谱分为原子光谱和分子光谱。

• 原子吸收光谱是由原子外层电子选择性地吸收某些波长的电磁波引起的。原子吸收分光光度法就是依据原子的这种性质建立起来的，其吸收光谱显示为线状光谱。
  
• 分子吸收光谱比较复杂，显示为带状光谱，这是由分子结构的复杂性所决定的。 
  

分子由原子组成，原子中的电子围绕着原子核运动。化合物分子中的电子总是处于某种运动状态，而每种运动状态都具有一定的能量，相对应于一定的能级。分子中的电子受到光、热、电等的刺激时，其总能量发生变化，电子从较低能级转到较高能级，拥有了比原来高的能量，这一过程称为跃迁，分子也由基态转变为激发态。分子在吸收能量的过程中产生了吸收光谱。由于分子内部运动所涉及的能级变化复杂，因此分子吸收光谱也表现得比较复杂
所得到的分子吸收光谱由于谱线之间的波长间隔只有0.25 nm，几乎是连续的，其形状呈现为带状，故分子光谱为带状光谱

不同结构的分子对光具有不同的吸收能力，有选择地吸收一定能量的光（一定波长的光），即分子对光的吸收具有高度的专一性。一定分子结构的分子只能吸收一定波长的光，因而不同物质具有不同的分子吸收光谱。这就是分子光谱可用于定性分析的理论基础。可以根据吸收光谱的形状和波长位置对被测物质进行基本判断

• 离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度
  
• 观察所处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能较好除去血浆蛋白的原因
  

• 每测一次波长，必需重新较正零点。
  
• 气瓶总开关和减压阀都已开启并调好，不可再 自行扭动，只需开、关两通上的活塞，按时间通入气体即可
  
• 高铁氰化钾临用前配置，贮存于棕色瓶中
  

条件温和

操作简便

损失少，回收率高

层析柱可反复使用

影响泳动度的因素

1.电荷效应

2.样品的浓缩效应

3.分子筛效应

4.SDS-PAGE 

• 酮体是乙酰乙酸、β-羟丁酸及丙酮3种物质的总称。
  
• 酮体是脂肪酸在肝脏氧化分解时形成的特有中间代谢物，是在特殊情况下肝脏向外输出能源的一种特殊方式。
  
• 酮体代谢的重要特征是肝内生酮肝外用
  

以丁酸作为底物与肝组织匀浆(内含合成酮体的酶系)保温后，即有酮体生成。酮体可与显色粉(亚硝基铁氰化钠等)产生紫红色物质反应；而经同样处理的肌肉匀浆则不产生酮体，故无显色反应

血清中的钙离子在碱性溶液中与甲基百里香酚蓝（MTB）结合，生成一种蓝色的络合物。加入适量8-羟基喹啉，可消除镁离子对测定的干扰，与同样处理的钙标准液进行比较，求得血清总钙含量

• MTB与EDTA有相似的氨羧结构，能鳌合多种阳离子，但络合稳定常数不同。
  
• 所用的试管清洗后用去离子水浸泡两次，再烤干备用。清洁管加入试剂后应显一致的浅灰绿色，若显蓝色则试管表示有污染。
  
• EDTA的用量选择，绝大部分金属离子与EDTA的络合稳定常数大于钙，小于钙的仅是少数微量元素。限量的EDTA仅能掩蔽试剂中的干扰元素，没有多余的EDTA络合血清钙，一般加入配试剂的EDTA浓度为99~108μmol/L，最终络合显色反应的EDTA浓度为50~54 μmol/L。
  
• 加入EDTA的作用，目的在于掩蔽试剂中的污染的钙以及其他的金属离子。能降低空白管吸光度，提高测定管吸光度，从而使方法灵敏度提高。 
  

在碱性溶液中，双缩脲能与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比

蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此可以发生双缩脲反应，双缩脲法测定蛋白质范围约1-10mg

双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同

缺点是灵敏度较低

是临床测定血清总蛋白质首选的最方便、实用的常规方法

（1）电热恒温水浴锅
（2）紫外-可见分光光度计

（1）40mmol/L苦味酸溶液
（2）0.75mol/L氢氧化钠
（3）35mmol/L钨酸钠溶液（排除其它蛋白的干扰）
（4）10mmol/L肌酐标准应用液
（5）10μmol/L肌酐标准应用液
（6）血清
（7）蒸馏水