生物选三

诱导生根，此时CTK小于IAA

再分化+光照，诱导生芽此时CTK大于IAA

脱分化为愈伤组织（薄壁组织团块）此时CTK=IAA

外植体（形态学下端插入培养基中）

过程

植物组织培养技术

植物细胞的全能性，植物细胞具有一定的流动性

原理

开始植物组织培养

再生出细胞壁{标志着细胞融合成功}（通过质壁分离来验证）

生成杂交原生质体

细胞融合方法：{物理}离心法电融合法{化学}高Ca—高PH法PEG诱导融合法

细胞A，细胞B经纤维素酶果胶酶处理去除细胞壁

植物体细胞杂交技术

植物细胞工程

贴壁生长类细胞在进行传代培养时要先用那两种酶使细胞分散之后离心收集，进行传代培养【杂交瘤细胞是悬液培养】一般用的都是十代以内的细胞，防止遗传物质改变

放入合成培养基，开始原代培养。

取动物组织，剪碎，用胰蛋白酶胶原蛋白酶制成细胞悬液

【三】指三个指标：PH值，温度，渗透压【营】营养条件{无机盐，水，糖，Aa，维生素，血清10%~20%}【无】无菌无毒环境【气】气体环境95%空气和5%的CO2。空气是维持细胞代谢，二氧化碳是维持培养基PH值

”三营无气“

培养条件

动物细胞培养技术

杂交瘤细胞

克隆化培养，抗体阳性检测

HAT培养基选择培养，筛选出B-骨细胞

{乱炖}骨-骨细胞+B-B细胞+骨-B细胞+B细胞+骨细胞

融合方法{物理}电融合法{化学}PEG融合法{生物}灭活病毒诱导法

骨髓瘤细胞

小鼠的B淋巴细胞

过程（以杂交瘤细胞为例）

动物体细胞融合技术

动物细胞核具有全能性

移植至受体体内着床

在体外培育至桑葚胚或囊胚期【3】

激活重构胚{方法}1.电刺激法2.Ca离子载体法3.乙醇4.蛋白酶合成抑制剂

形成重构胚

融合电刺激法

体细胞

动物细胞核移植技术

动物细胞工程

细胞工程

需要培养基额外补充营养

植物细胞的全能性

每一个细胞中都含有该生命体的全套基因

原因

培育出杂种细胞

【体细胞杂交完成的标志】

杂交细胞的染色体数为两种细胞之和，染色体组数也是两种细胞之和

【注意】

实现了远缘杂交，突破了生殖隔离

【优点】

指细胞自身生命活动所必需的产物

克隆

【融合成功的标志】细胞核的融合。【意义】突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。

【单克隆抗体的优势】特异性高，灵敏度好，可大量制备

植物的细胞一般培养到愈伤组织就分散成细胞悬液了

细胞产物的工厂化生产

【优点】脱毒苗产量高，产品品质好

取茎尖部位进行组织培养

脱毒苗培养

衍生技术

初生代谢产物

次生代谢产物

指不是细胞维持生命活动所必需的产物

【原理】细胞膜具有一定的流动性

ips细胞具有组织特异性，无发育成完整个体的能力

ES细胞与ips细胞

应用

给奶牛打促性腺激素，使其超数排卵，获得卵细胞。培育至MⅡ中期【2】去核【1】

指精子与卵子结合形成合子的过程

【受精阶段】1.精子穿过透明带。注意透明带反应，精子接触到卵细胞膜后才发生。2.精子接触卵细胞膜。精子外膜与卵细胞膜融合后发生卵细胞膜反应。3.精子入卵后。形成雄原核，尾部脱离。同时卵子发育到MⅡ期。注意雄原核是在精子外膜破裂后重新形成的，并且体积比原来的要大。之后精子入卵引起的刺激使卵子产生雌原核。雌雄原核彼此接近，核膜消失，合子形成，第一次卵裂即将开始。注意：受精的标志是观察到第二极体被排出。受精完成的标志是雌雄原核形成合子。

【准备阶段】{精子获能}精子的头部有异能因子抑制其受精能力。需要在雌性生殖道内或在获能液中获能。{卵子的准备}卵细胞需要在MⅡ期的时候才具备受精能力。而马狗排出的卵子是初级卵母细胞，猪羊排出的是次级卵母细胞。

【场所】输卵管或体外

受精

体外受精

在囊胚期细胞开始分化为内细胞团和滋养层细胞。在囊胚期和桑葚胚进行胚胎移植。滋养层细胞会分化为胎儿的胎盘和胎膜。

受精卵-2细胞胚-四细胞胚...-{32细胞}桑葚胚-囊胚期-原肠胚

【胚胎的早期发育】

胚胎移植

注意要均等分割。此种获得同卵多胎的生殖方式是无性生殖。囊胚期的滋养层细胞可做遗传学检测。

胚胎分割

胚胎工程

【1】“去核”是指去除纺锤体和染色质的混合物，去核的方法有显微操作，紫外线照射，梯度离心，化学物质处理。后三种目的主要是使DNA失活。           为什么要去核？           保证克隆动物的遗传物质最大限度地来自供体细胞。

【2】应用MⅡ中期的卵母细胞去核来作为受体细胞，是因为{1}卵母细胞大，方便操作{2}卵母细胞中的细胞质中激活体细胞核DNA全能型的营养和物质条件充足。        为什么不只将供体细胞的细胞核注入卵母细胞中而是整个细胞注入？        {1}对卵母细胞伤害较小{2}保证供体细胞核不被破坏{3}方便操作

DNA的提取和鉴定，注意酒精一定是95%并遇冷的！是为了抑制水解酶的活性和DNA的水解，增强DNA的韧性。提取DNA时如果使用离心机则取上清液。DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，且浓度不一样时DNA溶解度也不一样。提取的原理是DNA不溶于乙醇但某些蛋白质溶于乙醇。鉴定DNA时用二苯胺溶液沸水浴5分钟，变蓝则有DNA。

实验

对环境有一定的基因污染（花粉）

基因重组

【运输车】基因表达载体

【缝合线】DNA连接酶

【手术刀】限制性内切核酸酶

工具

【分子水平：PCR技术/DNA分子杂交（基因探针）阳性就说明目标DNA在顶上。若检验DNA是否转录出相应蛋白质则要用抗原-抗体杂交技术。阳性就是有了。【个体水平：看它抗啥就给它来啥

【第四步：目的基因的检验与测定】

方法：感受态细胞法{原核细胞}          农杆菌转化法{植物细胞}          花粉管通道法{植物细胞}           显微注射法{动物细胞}

【第三步：将目的基因导入受体细胞】

目的基因与载体（质粒）的接口处理常采用双酶切，目的是防止“两个环化”和“一个反接”。防止质粒/目的基因（因为回文序列一样而）自身环化，防止目的基因与质粒接反（回文序列的本质是一串具有对称中心的DNA序列）质粒要有复制原点，启动子，终止子，目的基因，标记基因，有些还有T-DNA。

【第二步：构建基因表达载体】（是核心环节）

【获取】1人工合成。2基因文库中寻找后PCR扩增。注意PCR扩增的过程图！记牢。高温变性为90~95°（最佳90），低温复性为50~55°（最佳50），延伸为70~75°（最佳72）【筛选】琼脂糖凝胶电泳

【第一步，目的基因的筛选和获取】

基因工程

选三

【菌种】毛霉【反应】分泌蛋白酶，脂肪酶，肽酶，脂肪酶将脂肪分解为甘油，脂肪酸；另外两个将Pr分解为Aa和小分子肽。

腐乳

【菌种】乳酸菌（严格厌氧菌，原核）【反应】C6H12O6→2C3H6O3（乳酸）+E【条件】盐水浓度适宜：5%~20%。过高发酵受到抑制，过低杂菌容易繁殖。盐水八成满，方便捞取，防止溢出，防止不能浸没蔬菜。盐水要煮沸杀菌，然后冷却到一定温度再倒入容器中，为了防止太烫影响乳酸菌的生命活动。【菌膜】意味着变质。酵母菌。

泡菜

【菌种】酵母菌（兼性厌氧菌，真核）【反应】有氧时与人体一样，可以简写（约去”→“两边的重复成分）无氧时将葡萄糖分解为乙醇和二氧化碳【温度】18~30°，最适28°。【菌膜】醋酸菌

酒

【菌种】醋酸菌（好氧菌，原核）【反应】将葡萄糖分解为乙酸和二氧化碳，缺少糖类的时候将乙醇先氧化为乙醛再氧化成乙酸和水。写方程式时别忘了加上能量！【温度】30~35°【菌膜】醋酸菌

醋

固体发酵

大豆提供Pr作为碳源

酱

半固体发酵

传统发酵

【从物理性质上说】固体cm，液体cm【从化学成分上说】人类自己配置的，知道具体成分的叫合成cm，不知道的叫天然cm【从功能上说】选择cm和鉴别cm

种类

配置

培养基（简写为cm）

【适用范围】cm，玻璃器皿，金属工具

【灭菌】干热灭菌（干热灭菌箱）湿热灭菌/高压蒸汽灭菌法（高压蒸汽灭菌锅），灼烧灭菌

【适用范围】超净工作台，水源，生物，不耐高温的液体

【消毒】巴氏消毒法煮沸化学消毒紫外线

无菌技术

将培养基灭菌后静置冷却到50°时开始倒入培养基。注意1.cm只能打开一道缝，不能大敞腰开。2.如果cm不小心倒入cm盖子与底盘之间的缝隙中那么cm只能作废。3.注意培养时要倒置，防止冷凝水倒流污染cm。4.写cm编码的时候要写在皿的底部。

倒平板

注意接种时cm也只能开小缝

梯度稀释菌液，然后用涂布器涂布。满足计数条件的cm的菌落数为30~300.一个稀释倍数下至少要三个数值的平均值.

稀释涂布平板法

平板划线法划线前烧，划线后也要烧，注意最后的线不能与第一条线相交。

接种

微生物培养技术

通过平板划线法/稀释涂布平板法接种到cm上，进行选择培养/鉴别培养/扩大培养，并选育菌种。

过程/思路

微生物的纯培养

发酵技术

利用微生物的特定功能来规模化生产人类所需的物品

概念

【注意】谷氨酸要在中/弱碱性条件下生产。

酱油，柠檬酸，酒，谷氨酸（味精），酶，单细胞蛋白

例子

提纯产品

发酵【核心技术】

灭菌

配制培养基（营养均衡，PH适宜）

选三·发酵工程