微生物常用实验
2025-09-01 09:49:50 3 举报AI智能生成
微生物检验常用试验步骤
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大纲/内容
实验前准备工作
按检测项目消毒所需器皿及仪器等
培养皿等玻璃器皿( 烘箱 160°-180° / 2h )<br>
洗脱液体,枪头等( 高压蒸汽灭菌锅 121° 30min)<br>
菌检一更至菌检室及超净工作台紫外实验前提前一小时开启 (阳性一更至阳性菌室及工作台同要求)<br>
注意事项:<br>
注意高压蒸汽灭菌锅的使用安全,每次使用前检查密封圈及参数等
玻璃器皿易碎(破碎玻璃器皿不得直接扔垃圾桶 需用纱布包裹统一处理)<br>
需氧菌检测
根据所需检测样品配制培养基
洗脱液(Nacl生理盐水)<br>
样品数量加一个阴性对照
每个每个样需要洗脱液
使用250ml锥形瓶分装100ml洗脱液<br>
胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA) <br>
样品数量乘以2加一个阴性对照
每个样所需培养基
每个平皿倒25ml
操作步骤
检测前用75%酒精擦拭自封袋表面4-5次,送入百级净化台内,在百级净化条件下取出供试品<br>
在酒精灯附近用无菌剪刀剪碎(10g)放入所对应的洗脱液体中,盖好,振荡10min,制得供试液<br>
在百级净化台内移液枪接种1ml供试液到培养基中
倒入对应培养基轻轻摇晃均匀放置5-10min后培养基凝固
培养
倒置放入恒温培养30-35° 培养3-5天
注意事项:<br>
注意操作手法规范
注意酒精灯使用安全
霉菌和酵母菌检测
根据所需检测样品配制培养基
沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA) <br>
样品数量乘以2加一个阴性对照<br>
每个平皿倒25ml
操作步骤
检测前用75%酒精擦拭自封袋表面4-5次,送入百级净化台内,在百级净化条件下取出供试品<br>
在酒精灯附近用无菌剪刀剪碎(10g)放入所对应的洗脱液体中,盖好,振荡10min,制得供试液<br>
在百级净化台内移液枪接种1ml供试液到培养基中
倒入对应培养基轻轻摇晃均匀放置5-10min后培养基凝固
培养
倒置放入霉菌培养箱20-25° 培养5-7天
注意事项<br>
注意操作手法规范
注意酒精灯使用安全
洁净区环境检测
根据所需检测样品配制培养基
少于10人取3个样 / 大于10人取5个样
洗脱液(Nacl)<br>
样品数量加一个阴性对照,再加100ml用于分装棉球
每根试管分装10ml
胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)<br>
沉降菌房间数量(提前一天配制好)<br>
对应样品数量 乘以2 加一个阴性对照
琼脂培养基(R2A) <br>
样品数量加一个阴性对照
每个平皿倒25ml
取样所需工具
筐 / 酒精灯/ 打火机 / 棉球 / 镊子 / 笔 / 试管架 / 口罩 / 手套 / 75%酒精 / 无尘纸 / 消毒液标签 / 人员名单 <br>
操作步骤
沉降菌
离地0.8-1.5米 30min
手菌/工作服/工作台面/周转箱
用镊子取棉球在取样区来回擦拭10个来回,用无菌手法放入对应试管待测
振荡器振荡10min
按对应标识吸取1ml于平皿中
培养皿倒入对应培养基,轻轻摇晃均匀
纯化水
接水点放水1min后 再取样
培养
30-35° 3天
注意事项<br>
试管开启需酒精灯外焰,灼烧管口外壁3圈左右
开启试管用右手两指反夹取出底朝下放在酒精灯10cm范围内
生物指示剂BI无菌<br>
根据所需检测样品配制培养基
胰酪大豆胨液体培养基(TSB)<br>
一般12个样加一个阳性对照 共13个
每个试管分装100ml
试管标识<br>
样品日期
编号: A1,B2,C3,以此类推<br>
操作步骤
按编号将指示剂用无菌手法放入试管
培养
30-35°培养7天
注意事项<br>
阳性必须在阳性菌室,实验结束相关物品需灭活处理
无菌检测
根据委外灭菌预约通知单单号,进入系统查看灭菌批号
取样
创口贴
取样45片
其余
取样30片
取密度最大产品(如表面积太小就选表面积最大的)<br>
取表面积最大(名称后数相乘)<br>
取数量最多(有相同批号选择数量最多)<br>
根据所需检测样品配制培养基
胰酪大豆胨液体培养基(TSB) <br>
硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)<br>
洗脱液
金葡所需3支 加白念所需3支 加阴性 1支
样品数量乘以5 因需要2种培养基所以数量再乘以2<br>
配制数量
加阴性试管4(其中2根用于备用)<br>
加阳性菌组(因所需2种培养基,检测样品数量乘以2)<br>
操作步骤
阴性
每个培养基5根管,每5根试管1个样<br>
标识对应样品名称,料号,批号,日期
每根试管加入对应样品1g
阳性
菌种45°温水复苏
金葡
第一支10ml (10的负一次方) 加入复苏后金葡0.2ml 移入2粒瓷珠振荡<br>
第二支9ml(10的负二次方) 加入第一支稀释后金葡1ml振荡<br>
第三支9ml(10的负三次方)加入第二支稀释后金葡1ml振荡待用<br>
白念
第一支10ml (10的负一次方) 加入复苏后白念0.2ml 移入2粒瓷珠振荡<br>
第二支9ml(10的负二次方) 加入第一支稀释后白念1ml振荡<br>
第三支9ml(10的负三次方)加入第二支稀释后白念1ml振荡待用<br>
第三支(10的负三次方)<br>
金葡
移取1ml加入FTM硫乙醇酸盐流体培养基待用<br>
白念
移取1ml加入TSB胰酪大豆胨液体培养基待用<br>
对应检测样品数量<br>
FTM硫乙醇酸盐流体培养基加(金葡)<br>
每根试管加入1g样
TSB胰酪大豆胨液体培养基加(白念)<br>
每根试管加入1g样
培养
FTM硫乙醇酸盐流体培养基<br>
30-35° 14天<br>
TSB胰酪大豆胨液体培养基<br>
20-25° 14天
注意事项<br>
注意操作手法规范
注意酒精灯使用安全
阳性试验结束对相关试验场景仪器灭活处理
实验结果计算
需氧菌
计算公式; A平皿菌落数量 加 B平皿菌落数量 除以 2 乘以 1.3 (校正因子) 乘以 10 (稀释倍数)<br>
原料类( ≤100cfu/g 警戒线≤60cfu/g 行动线≤80cfu/g)<br>
非灭菌半成品/成品( ≤100cfu/g 警戒线≤60cfu/g 行动线≤80cfu/g)
灭菌前半成品( ≤100cfu/g 警戒线≤70cfu/g 行动线≤80cfu/g)
霉菌/酵母菌
计算公式; A平皿菌落数量 加 B平皿菌落数量 除以 2 乘以 1.3 (校正因子) 乘以 10 (稀释倍数)<br>
原料类( ≤10cfu/g )<br>
非灭菌半成品/成品( ≤10cfu/g )<br>
灭菌前半成品( ≤10cfu/g )<br>
手菌 <br>
计算公式;A平皿菌落数量 加 B平皿菌落数量 除以 2 乘以 1.2 (校正因子) 乘以 10 (稀释倍数)<br>
(≤300cfu / hand 警戒线 ≤200cfu / hand 行动线 ≤240cfu / hand )<br>
衣服/工作台/周转箱 <br>
计算公式;A平皿菌落数量 加 B平皿菌落数量 除以 2 乘以 12 除以25<br>
(≤10cfu cm² 警戒线 ≤6cfu cm² 行动线≤8cfu cm² )<br>
沉降菌<br>
计算公式;平皿菌落总数相加除以平皿数量
(百级≤1 万级≤3 十万级≤10)
注意事项 <br>
计算结果写整数
菌落总数较多时使用分区计数
常用培养基
TSA 胰酪大豆胨琼脂培养基 (需氧菌) 30-35度 3-5天<br>
TSB 胰酪大豆胨液体培养基 (无菌) 20-25度 生物指示剂7天 / 无菌14天<br>
R2A 琼脂培养基 (需氧菌) 30-35度 3-5天<br>
SDA 沙氏葡萄糖琼脂培养基 (霉菌和酵母菌) 20-25度 5-7天<br>
FTM 硫乙醇酸盐流体培养基 (无菌) 30-35度 14天<br>
Nacl 氯化钠 (生理盐水) 洗脱液<br>
吐温80 (乳化剂 / 增溶剂) <br>
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