微生物常用实验
2025-09-01 09:49:50 0 举报AI智能生成
微生物检验常用试验步骤
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大纲/内容
实验前准备工作
按检测项目消毒所需器皿及仪器等
培养皿等玻璃器皿( 烘箱 160°-180° / 2h )
洗脱液体,枪头等( 高压蒸汽灭菌锅 121° 30min)
菌检一更至菌检室及超净工作台紫外实验前提前一小时开启 (阳性一更至阳性菌室及工作台同要求)
注意事项:
注意高压蒸汽灭菌锅的使用安全,每次使用前检查密封圈及参数等
玻璃器皿易碎(破碎玻璃器皿不得直接扔垃圾桶 需用纱布包裹统一处理)
需氧菌检测
根据所需检测样品配制培养基
洗脱液(Nacl生理盐水)
样品数量加一个阴性对照
每个每个样需要洗脱液
使用250ml锥形瓶分装100ml洗脱液
胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)
样品数量乘以2加一个阴性对照
每个样所需培养基
每个平皿倒25ml
操作步骤
检测前用75%酒精擦拭自封袋表面4-5次,送入百级净化台内,在百级净化条件下取出供试品
在酒精灯附近用无菌剪刀剪碎(10g)放入所对应的洗脱液体中,盖好,振荡10min,制得供试液
在百级净化台内移液枪接种1ml供试液到培养基中
倒入对应培养基轻轻摇晃均匀放置5-10min后培养基凝固
培养
倒置放入恒温培养30-35° 培养3-5天
注意事项:
注意操作手法规范
注意酒精灯使用安全
霉菌和酵母菌检测
根据所需检测样品配制培养基
沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)
样品数量乘以2加一个阴性对照
每个平皿倒25ml
操作步骤
检测前用75%酒精擦拭自封袋表面4-5次,送入百级净化台内,在百级净化条件下取出供试品
在酒精灯附近用无菌剪刀剪碎(10g)放入所对应的洗脱液体中,盖好,振荡10min,制得供试液
在百级净化台内移液枪接种1ml供试液到培养基中
倒入对应培养基轻轻摇晃均匀放置5-10min后培养基凝固
培养
倒置放入霉菌培养箱20-25° 培养5-7天
注意事项
注意操作手法规范
注意酒精灯使用安全
洁净区环境检测
根据所需检测样品配制培养基
少于10人取3个样 / 大于10人取5个样
洗脱液(Nacl)
样品数量加一个阴性对照,再加100ml用于分装棉球
每根试管分装10ml
胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)
沉降菌房间数量(提前一天配制好)
对应样品数量 乘以2 加一个阴性对照
琼脂培养基(R2A)
样品数量加一个阴性对照
每个平皿倒25ml
取样所需工具
筐 / 酒精灯/ 打火机 / 棉球 / 镊子 / 笔 / 试管架 / 口罩 / 手套 / 75%酒精 / 无尘纸 / 消毒液标签 / 人员名单
操作步骤
沉降菌
离地0.8-1.5米 30min
手菌/工作服/工作台面/周转箱
用镊子取棉球在取样区来回擦拭10个来回,用无菌手法放入对应试管待测
振荡器振荡10min
按对应标识吸取1ml于平皿中
培养皿倒入对应培养基,轻轻摇晃均匀
纯化水
接水点放水1min后 再取样
培养
30-35° 3天
注意事项
试管开启需酒精灯外焰,灼烧管口外壁3圈左右
开启试管用右手两指反夹取出底朝下放在酒精灯10cm范围内
生物指示剂BI无菌
根据所需检测样品配制培养基
胰酪大豆胨液体培养基(TSB)
一般12个样加一个阳性对照 共13个
每个试管分装100ml
试管标识
样品日期
编号: A1,B2,C3,以此类推
操作步骤
按编号将指示剂用无菌手法放入试管
培养
30-35°培养7天
注意事项
阳性必须在阳性菌室,实验结束相关物品需灭活处理
无菌检测
根据委外灭菌预约通知单单号,进入系统查看灭菌批号
取样
创口贴
取样45片
其余
取样30片
取密度最大产品(如表面积太小就选表面积最大的)
取表面积最大(名称后数相乘)
取数量最多(有相同批号选择数量最多)
根据所需检测样品配制培养基
胰酪大豆胨液体培养基(TSB)
硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)
洗脱液
金葡所需3支 加白念所需3支 加阴性 1支
样品数量乘以5 因需要2种培养基所以数量再乘以2
配制数量
加阴性试管4(其中2根用于备用)
加阳性菌组(因所需2种培养基,检测样品数量乘以2)
操作步骤
阴性
每个培养基5根管,每5根试管1个样
标识对应样品名称,料号,批号,日期
每根试管加入对应样品1g
阳性
菌种45°温水复苏
金葡
第一支10ml (10的负一次方) 加入复苏后金葡0.2ml 移入2粒瓷珠振荡
第二支9ml(10的负二次方) 加入第一支稀释后金葡1ml振荡
第三支9ml(10的负三次方)加入第二支稀释后金葡1ml振荡待用
白念
第一支10ml (10的负一次方) 加入复苏后白念0.2ml 移入2粒瓷珠振荡
第二支9ml(10的负二次方) 加入第一支稀释后白念1ml振荡
第三支9ml(10的负三次方)加入第二支稀释后白念1ml振荡待用
第三支(10的负三次方)
金葡
移取1ml加入FTM硫乙醇酸盐流体培养基待用
白念
移取1ml加入TSB胰酪大豆胨液体培养基待用
对应检测样品数量
FTM硫乙醇酸盐流体培养基加(金葡)
每根试管加入1g样
TSB胰酪大豆胨液体培养基加(白念)
每根试管加入1g样
培养
FTM硫乙醇酸盐流体培养基
30-35° 14天
TSB胰酪大豆胨液体培养基
20-25° 14天
注意事项
注意操作手法规范
注意酒精灯使用安全
阳性试验结束对相关试验场景仪器灭活处理
实验结果计算
需氧菌
计算公式; A平皿菌落数量 加 B平皿菌落数量 除以 2 乘以 1.3 (校正因子) 乘以 10 (稀释倍数)
原料类( ≤100cfu/g 警戒线≤60cfu/g 行动线≤80cfu/g)
非灭菌半成品/成品( ≤100cfu/g 警戒线≤60cfu/g 行动线≤80cfu/g)
灭菌前半成品( ≤100cfu/g 警戒线≤70cfu/g 行动线≤80cfu/g)
霉菌/酵母菌
计算公式; A平皿菌落数量 加 B平皿菌落数量 除以 2 乘以 1.3 (校正因子) 乘以 10 (稀释倍数)
原料类( ≤10cfu/g )
非灭菌半成品/成品( ≤10cfu/g )
灭菌前半成品( ≤10cfu/g )
手菌
计算公式;A平皿菌落数量 加 B平皿菌落数量 除以 2 乘以 1.2 (校正因子) 乘以 10 (稀释倍数)
(≤300cfu / hand 警戒线 ≤200cfu / hand 行动线 ≤240cfu / hand )
衣服/工作台/周转箱
计算公式;A平皿菌落数量 加 B平皿菌落数量 除以 2 乘以 12 除以25
(≤10cfu cm² 警戒线 ≤6cfu cm² 行动线≤8cfu cm² )
沉降菌
计算公式;平皿菌落总数相加除以平皿数量
(百级≤1 万级≤3 十万级≤10)
注意事项
计算结果写整数
菌落总数较多时使用分区计数
常用培养基
TSA 胰酪大豆胨琼脂培养基 (需氧菌) 30-35度 3-5天
TSB 胰酪大豆胨液体培养基 (无菌) 20-25度 生物指示剂7天 / 无菌14天
R2A 琼脂培养基 (需氧菌) 30-35度 3-5天
SDA 沙氏葡萄糖琼脂培养基 (霉菌和酵母菌) 20-25度 5-7天
FTM 硫乙醇酸盐流体培养基 (无菌) 30-35度 14天
Nacl 氯化钠 (生理盐水) 洗脱液
吐温80 (乳化剂 / 增溶剂)
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